王道++施曉波++陳建林

摘要胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinelike growth factors，IGFs）是一類具有胰島素樣代謝和促進(jìn)有絲分裂功能的多肽，包括IGF1和IGF2，對(duì)調(diào)節(jié)垂體生長(zhǎng)激素合成和分泌起著重要的作用，同時(shí)還參與了細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化等過程.利用RTPCR在mRNA水平上檢測(cè)了IGF1/2基因在金魚不同組織和不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá).結(jié)果表明，IGF1基因在肝臟中的表達(dá)量最高，在大腦、肌肉及精巢的表達(dá)量相對(duì)較低；IGF2基因在脾臟中的表達(dá)量最高，在腎臟、卵巢及精巢的表達(dá)量相對(duì)較低.IGF1/2基因在不同發(fā)育時(shí)期基本上呈現(xiàn)由低到高的趨勢(shì).研究表明，IGF1/2基因在金魚的不同組織和胚胎發(fā)育過程中可能具有重要的作用，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究.

關(guān)鍵詞IGF1/2；金魚；組織器官；胚胎發(fā)育

中圖分類號(hào)Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537（2017）02004405

The Temporal and Tissue Expression Patterns of IGF1/2

Gene in Goldfish（Carassius Auratus）

WANG Dao， SHI Xiaobo， CHEN Jianlin*

（Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410011， China）

AbstractInsulinlike growth factors （IGFs）， including IGF1 and IGF2， are a class of polypeptides with insulinlike metabolic and mitogenic functions. It not only plays an important role in regulating pituitary hormone synthesis and secretion， but also involved in cell proliferation and growth and differentiation processes. In this work， RTPCR was used to examine the expression of IGF1/2 gene in different tissues and periods of embryonic development at the mRNA level in goldfish. Our results reveal that the IGF1 gene was expressed the highest level in the liver and to a much less degree in the brain， muscle and testis of goldfish， whereas IGF2 was expressed the highest in the spleen but relatively low in the kidney， ovary and testis. The IGF1/2 genes were expressed differently at different developmental stages， with the pattern of “l(fā)ow to high” trend. These studies suggest that IGF1/2 genes should play important roles in embryonic development and in different tissues of goldfish. The exact mechanism remains to be further investigated.

Key wordsIGF1/2； goldfish； tissue organ； embryonic development

胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinelike growth factors，IGFs）在調(diào)節(jié)魚類的垂體生長(zhǎng)激素合成和分泌中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[12].IGFs是一類具有胰島素樣代謝和促進(jìn)有絲分裂功能的多肽，依照IGF的性能可以分為IGF1和IGF2.胰島素樣生長(zhǎng)因子是由大多數(shù)器官和身體組織產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，它們對(duì)機(jī)體代謝和細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、自分泌、旁分泌等起作用，而且大多數(shù)已知的IGF信號(hào)都是通過胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體（IGF1R）來(lái)介導(dǎo)的.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1主要參與介導(dǎo)生長(zhǎng)激素（GH）產(chǎn)生內(nèi)分泌的效應(yīng)，IGF1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)由與存在于細(xì)胞膜表面的IGF1受體（IGF1R）結(jié)合，其胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域連接到RASRAFMAPK和PI3KPKB/AKT信號(hào)或胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）/有絲分裂原活化蛋白激酶（MAP）啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路，以激活細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，并抑制程序性細(xì)胞死亡[34].IGF2是一種廣泛表達(dá)的多肽激素，主要在肝臟和子宮內(nèi)通過胎盤分泌，是胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子.Kadakia[5]等發(fā)現(xiàn)IGF2基因的過表達(dá)與胎兒的過度生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)，并且在脂肪組織的生成中發(fā)揮重要作用.隨著進(jìn)一步的研究，IGF2可能成為未來(lái)嬰幼兒肥胖的標(biāo)記物[6].

迄今為止，研究人員在高等哺乳動(dòng)物中對(duì)IGFs系統(tǒng)的研究已經(jīng)成熟，但是對(duì)于低等魚類系統(tǒng)的研究還非常少，主要集中在日本鰻鱺、虹鱒、金頭鯛和斑馬魚等少數(shù)魚類[710].為了研究IGF1/2基因在低等脊椎動(dòng)物胚胎及組織中的表達(dá)與功能，作者以金魚為實(shí)驗(yàn)材料，初步分析IGF1/2基因在金魚不同的胚胎發(fā)育時(shí)期及不同組織的分化表達(dá)模式，以期為后續(xù)探討IGF1/2基因的功能提供一定的基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需的金魚源自湖南長(zhǎng)沙花鳥蟲魚大市場(chǎng)， 靜水養(yǎng)殖在玻璃缸中.用小手術(shù)剪刀沿泄殖孔剪開腹部，小心取出8種主要的組織器官：大腦、肌肉、心臟、腎臟、脾臟、肝臟、卵巢和精巢，然后用鑷子放入標(biāo)記好的1.5 mL EP管中，用液氮快速封存，置于-80 ℃冰箱備用.金魚12個(gè)時(shí)期的胚胎是在高倍體視鏡的觀察下，通過精卵結(jié)合受精來(lái)獲得的.12個(gè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期分別是：兩細(xì)胞、多細(xì)胞、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、視原期、腦泡期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、眼色素期、體色素期和出膜期.每個(gè)1.5 mL EP管置入不同時(shí)期的胚胎數(shù)目50個(gè)左右并標(biāo)記，同樣快速用液氮封存，置于-80 ℃冰箱備用.

1.2主要試劑及儀器

上海生物工程有限公司合成的IGF1/2 基因特異性引物一對(duì)；2xTaq PCR Mastermix（KT201）（北京天根生化科技有限公司）；總RNA提取試劑盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）（日本Takara公司）；快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit）（美國(guó)Fermentas公司）；Biophotometer 核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Beckmancoulter公司）； S1000 Thermal Cycler PCR儀（美國(guó)BioRad公司）；EGel imager凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher公司）.

1.3RNA的提取

提取金魚8種不同組織和12個(gè)胚胎時(shí)期的Total RNA，采用Takara公司的總RNA提取試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn).瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA是否提取成功.如果在凝膠電泳圖上出現(xiàn)28S和18S兩條帶，且無(wú)拖帶現(xiàn)象，28S的亮度是18S的二倍，則證明提取RNA成功.

1.4反轉(zhuǎn)錄PCR

在PCR儀上通過Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取8個(gè)組織器官和12個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期 cDNA模板，用引物軟件設(shè)計(jì)IGF1特異引物（正向5′AAGTGTACCATGCGCTGTC3′；反向5′GAGTATCTGTATGCCGTTGC3′）；IGF2特異引物（正向5′GAAGTCGGAGCGAGATGTT3′；反向5′TGTCTTTCGGGAAGGGTCA3′）以及內(nèi)參βactin正反向引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)（見表1）.PCR反應(yīng)過程是預(yù)先加入設(shè)計(jì)合成的IGF1/2特異性引物，預(yù)變性94 ℃ 5 min，而后 10個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，接著65 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸60 s，然后加入內(nèi)參βactin 正反引物進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR 最終產(chǎn)物在電泳槽內(nèi)1.5%瓊脂糖凝膠跑膠15 min，在凝膠成像系統(tǒng)紫外光照射下檢測(cè)并拍照.

2結(jié)果

2.1IGF1基因在金魚不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的mRNA結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)IGF1基因在金魚8個(gè)組織中都存在表達(dá).在肝臟中的表達(dá)量最高，心臟、脾臟、腎臟次之，在大腦、肌肉及精巢的表達(dá)量相對(duì)較低（圖1）.

IGF1基因在金魚12個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期都存在表達(dá).在體色素和出膜期中的表達(dá)量最高，神經(jīng)胚、視原基、腦泡期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、眼色素期次之，在兩細(xì)胞期、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期的表達(dá)量相對(duì)較低.從兩細(xì)胞期到肌肉效應(yīng)期呈現(xiàn)“由低到高”趨勢(shì)，在心跳期、眼色素期稍有下降，在體色素和出膜期又逐漸升高直至維持高水平（圖2）.

2.2 IGF2基因在金魚不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的mRNA結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)IGF2基因在金魚8個(gè)組織中都存在表達(dá).在脾臟中的表達(dá)量最高，心臟、肌肉、肝臟次之，在腎臟、卵巢及精巢的表達(dá)量相對(duì)較低（圖3）.IGF2基因在金魚12個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期都存在表達(dá).在體色素和出膜期中的表達(dá)量最高，神經(jīng)胚、視原基、腦泡期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、眼色素期次之，在兩細(xì)胞期、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期的表達(dá)量相對(duì)較低.從兩細(xì)胞期、多細(xì)胞一直到體色素和出膜期呈現(xiàn)典型“由低到高”的逐漸升高趨勢(shì)（圖4）.

3討論

有絲分裂肽家族的胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）在生物體內(nèi)具有不同的功能，主要體現(xiàn)在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化有絲分裂原和細(xì)胞凋亡等過程[1112].胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)包括：?jiǎn)捂湺嚯牡腎GF1和IGF2以及6個(gè)結(jié)合蛋白（IGFBP1～I(xiàn)GFBP6）.IGF1和IGF2分別含有70和67個(gè)氨基酸，并且明顯類似胰島素原.胰島素樣生長(zhǎng)因子介導(dǎo)多個(gè)個(gè)體發(fā)育階段如胚胎期、嬰兒期、青春期、成年期，并存在于幾乎每一個(gè)級(jí)別的生命系統(tǒng)中，如細(xì)胞、組織、器官、生物體及基本生物過程.本研究發(fā)現(xiàn)在金魚中IGF1/2基因在不同組織及胚胎發(fā)育階段廣泛表達(dá)，這一結(jié)果也與上述結(jié)論一致.

許多研究人員已證實(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子家族與幾種代謝疾病相關(guān)聯(lián)，其中包括1型糖尿病，近年來(lái)甚至還有報(bào)道其與癌癥有關(guān)，特別是乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌，如Werner[13]等人通過流行病和臨床試驗(yàn)表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）是一個(gè)使表型正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞事件發(fā)生的生化鏈的重要介質(zhì).Bruchim的臨床研究數(shù)據(jù)也通過回顧一些具體的惡性腫瘤事件證實(shí)了IGFs系統(tǒng)的表達(dá)和作用的失調(diào)與不同的病癥有關(guān)，從而導(dǎo)致了癌癥的發(fā)展[14].Han[15]等研究調(diào)查了在糖尿病患者中胰島素樣生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白和大腸癌的發(fā)生幾率之間的關(guān)系，結(jié)果提示結(jié)直腸癌的糖尿病患者的發(fā)生可能與升高的IGFs相關(guān)蛋白表達(dá)水平相關(guān)聯(lián).Solarek[16]等發(fā)現(xiàn)IGF1和IGF2發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和分化的作用，試圖了解胰島素樣生長(zhǎng)因子的過度活化在癌癥發(fā)生過程中的主要機(jī)制，以此開辟新的抗癌療法來(lái)預(yù)防和治療常見的人類惡性腫瘤.

Zhou[17]等研究斑馬魚發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育的不同階段，胰島素樣因子扮演不同的角色，在不同的生理水平上調(diào)節(jié)IGF信號(hào)傳導(dǎo)的程度.Silva[18]等研究顯示IGF1對(duì)原始卵泡發(fā)育沒有作用效果，但I(xiàn)GF1和IGF2協(xié)同能夠刺激次級(jí)卵泡的生長(zhǎng)，在竇狀卵泡中，這些胰島素樣生長(zhǎng)因子刺激顆粒細(xì)胞增殖.IGF1/2基因在金魚胚胎發(fā)育早期的兩細(xì)胞、多細(xì)胞期到體色素和出膜期基本呈現(xiàn)由低到高的逐漸升高趨勢(shì)，該結(jié)果也表明其與魚類的生長(zhǎng)發(fā)育成熟密切相關(guān).

在哺乳動(dòng)物和魚類中，內(nèi)分泌的IGF1主要產(chǎn)生于肝臟，能夠刺激免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，并抑制細(xì)胞凋亡，是一種有效的生長(zhǎng)因子.Franz[19]等研究硬骨魚證實(shí)這種刺激作用經(jīng)常與升高的內(nèi)分泌（肝臟來(lái)源）的IGF1相關(guān).但是魚類中IGF2的作用仍然不清楚.本研究中IGF1基因在金魚的肝臟組織中表現(xiàn)出高度表達(dá)的特征，同時(shí)IGF2也在肝臟中有較高表達(dá).

特別讓科學(xué)家感興趣的是IGF1和IGF2在免疫中所發(fā)揮的重要作用.Ge[20]等為了研究IGF在腸道炎癥過程中的免疫機(jī)制，對(duì)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IGF1通過實(shí)時(shí)定量RTPCR和Western印跡進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示IGF1能夠在腸道中抑制免疫炎癥反應(yīng).Geng[21]則發(fā)現(xiàn)IGF1受體（IGF1R）和IGF2受體（IGF2R）在特異性B細(xì)胞表達(dá)，通過酶聯(lián)免疫試驗(yàn)證實(shí)其增強(qiáng)了白細(xì)胞介素（IL）10的釋放.一些研究還指出，自分泌/旁分泌的IGF1與成人免疫器官發(fā)育相關(guān)聯(lián).脾臟是體內(nèi)最大的淋巴免疫器官，在本研究中IGF1/2基因在金魚的脾臟中也存在高表達(dá)，但是關(guān)于IGF1在魚類組織中免疫細(xì)胞的不同定位的研究尚不夠多.IGF1僅被定位在不同哺乳動(dòng)物的免疫細(xì)胞類型，在T淋巴細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞中.在其它魚類研究中，IGF1在虹鱒魚頭腎分離的吞噬細(xì)胞和鯰魚細(xì)胞系的T細(xì)胞中被檢測(cè)到.總之，IGF1/2基因在魚類發(fā)育不同階段和不同的組織中廣泛表達(dá)，增加了區(qū)分研究它們的生物學(xué)功能的難度.后續(xù)基礎(chǔ)研究可以利用RNAi沉默或者突變基因的方法，揭示在魚類早期胚胎發(fā)育過程中IGF1/2的主要生理學(xué)作用和機(jī)制.

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（編輯WJ）