黃招琴++蘇壬香 鐘貝芬 韓慧敏 谷陟欣 顏冬蘭 辛秀 袁莉 胡翔

DOI：10.7612/j.issn.10002537.2017.02.005

摘要在CIK細胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對CIK細胞體外增殖及殺瘤活性等方面的影響.CCK8檢測結果發(fā)現(xiàn)低濃度卡介菌多糖核酸處理的CIK細胞相比對照組（生理鹽水），細胞增殖能力和殺瘤效果都顯著上調(diào).RTqPCR結果顯示卡介菌多糖核酸處理后的CIK細胞毒活性相關因子（Granzyme B， IFNγ， TNFα和TNFβ）mRNA的表達相比對照組都有提高.這些結果可為培養(yǎng)具有更高效殺瘤活性又能大量擴增的CIK細胞提供新思路.

關鍵詞卡介菌多糖核酸；CIK；細胞增值；殺瘤活性

中圖分類號Q78文獻標識碼A文章編號10002537（2017）02003306

The Impact of BCGPSN on the Activity of CIK Cells

HUANG Zhaoqin1， SU Renxiang1， ZHONG Beifen1， HAN Huimin2， GU Zhixin2， YAN Donglan2， XIN Xiu2， YUAN Li2， HU Xiang1，2*

（1.Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of State Education Ministry of China，

College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2.Jiuzhitang Limited Share Company Postdoctoral Workstation， Changsha 410205， China）

AbstractThe BCG polysaccharide and nucleic acid （BCGPSN） was added to CIK cells to study CIK cells responses on the proliferation and tumoricidal activity in vitro. CCK8 results showed that the CIK cells treated with low dose BCGPSN， compared with control group （normal saline）， were significantly enhanced on the proliferation and tumoricidal activity. RTqPCR results revealed that the expression of CIK Granzyme B， IFNγ， TNFα， TNFβ mRNA of BCGPSN group was higher than that of the control group. These results lay the foundation for how to cultivate a large number of CIK cells with high tumoricidal activity， and provide new ideas for the therapy of antitumor adoptive immunity.

Key wordsBCGPSN； CIK cell； cell proliferation；tumoricidal activity

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，目前常規(guī)的手術和放化療治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的瘤細胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優(yōu)點成為重要的腫瘤輔助治療手段[1].其中，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokineinduced killer cells， CIK細胞）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領域的一種新選擇[24].CIK是以CD3+CD56+ T細胞為主的異質細胞群，兼有 NK 細胞和 T 細胞的特征.在功能上，CIK 一方面擁有 T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有 NK 細胞非 MHC 限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微[5].CIK細胞的增殖和細胞毒活性依賴于多種外源性細胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經(jīng)成為抗腫瘤的過繼免疫細胞生物治療的一個熱點[6].

卡介菌多糖核酸（BCG polysaecharide and nucleis acid，BCGPSN）是在卡介苗的基礎上，通過熱酚法提取卡介菌中的多糖、核酸，混合而制成的免疫活性物質，是我國首創(chuàng)的具有自主知識產(chǎn)權的新型免疫調(diào)節(jié)劑[78].BCGPSN 能誘導多種免疫細胞的活化，調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌，可作為一種較好的腫瘤輔助治療手段[9].

由于卡介菌多糖核酸能提高機體免疫力并且輔助提高腫瘤治療效果，同時CIK細胞亦是腫瘤過繼免疫治療的有效方法，且國內(nèi)外還沒有BCGPSN聯(lián)合CIK進行研究的相關報道，因此本課題將兩者結合起來研究.為研究卡介菌多糖核酸的生物活性及藥理作用，在CIK細胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對CIK細胞的體外增殖及對肝癌細胞的毒活性（殺瘤活性）方面的影響，并且探討其對CIK細胞毒活性相關因子表達的影響.

1.材料與方法

1.1材料

淋巴細胞分離自健康志愿者外周血.SMMC7721肝癌細胞系于上海中科院購買，本實驗室長期保存.斯奇康卡介菌多糖核酸注射液（1 mL/支）購自湖南九芝堂制藥公司.人血液淋巴細胞分離液購自佳和生物.采血針、采血管、生理鹽水購自長沙市第四人民醫(yī)院.人源CD3單抗購自北京同立源生物科技有限公司，人白介素（IL2）買自江蘇金絲利藥業(yè)有限公司.DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640和GTT551培養(yǎng)液，以及胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品.青霉素鏈霉素溶液產(chǎn)自碧云天.

1.2方法

1.2.1CIK細胞分離及原代培養(yǎng)采集健康志愿者血液20 mL，平衡溫度至室溫.取50 mL離心管若干，將血樣轉移至離心管，用生理鹽水稀釋至30 mL，充分吹打均勻.將稀釋后的血樣緩緩加入另一管裝有15 mL 淋巴細胞分離液的上方，形成上下兩相.22 ℃，390 g離心30 min（加速1，剎車0）.離心后血漿層與分離液之間有白膜層可見，分別收集上層血漿和中間白膜層至新的離心管.于收集白膜層的離心管中加入RPMI1640至45 mL，混勻，22 ℃，1 000 g離心10 min（加速9，剎車9）.重復上一步驟兩次，離心速度分別改為400 g和201 g，最后一次離心之前取20 μL混勻的細胞懸液進行臺盼藍染色計數(shù)，參照《細胞計數(shù)SOP》.離心后重懸細胞，按細胞數(shù)5×106個/mL加含有500 μg/L CD3 mAB， 1 000 U/mL IL2和10%FBS的GTT551培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)成CIK細胞.

1.2.2腫瘤細胞培養(yǎng)在37 ℃，5%CO2及90%相對濕度的細胞培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和100 mg/L青鏈霉素溶液）培養(yǎng)SMMC7721細胞.

1.2.3CCK8 檢測細胞增殖活力將培養(yǎng)7 d的CIK細胞數(shù)調(diào)整至2×106 個/mL，于96 孔平底細胞培養(yǎng)板每孔加入細胞懸液50 μL，設實驗組和對照組，對照組為生理鹽水組，實驗組分為5組，分別加入卡介菌多糖核酸終濃度為1，10，50，100，200 mL/L的培養(yǎng)基各50 μL，每個濃度4個平行對照孔，置于細胞培養(yǎng)箱中處理細胞72 h，加入10 μL CCK8溶液，4 h 后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD450值A（吸光度的大小與活細胞的數(shù)量呈正比）.并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析.以BCGPSN 濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，作細胞增殖曲線.

1.2.4腫瘤殺傷實驗將培養(yǎng)9 d的CIK細胞均分為兩組，分別為對照組和實驗組，對照組為生理鹽水組，實驗組為培養(yǎng)基終濃度為10 mL/L的卡介菌多糖核酸，置于細胞培養(yǎng)箱中處理細胞72 h（至12 d）.另外，在CIK細胞培養(yǎng)11 d時，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SMMC7721細胞調(diào)整細胞密度為1×105 個/mL，于96孔板中鋪板每孔100 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.CIK培養(yǎng)至第12天進行CIK殺傷腫瘤細胞實驗，棄去SMMC7721舊的培養(yǎng)液，分別按n（效應細胞）/n（靶細胞）為5∶1，10∶1和20∶1調(diào)整兩組CIK細胞至相應數(shù)目加入SMMC7721細胞孔中，每個比例3個復孔，同時設單獨靶細胞和單獨效應細胞對照組，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h. 4 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀測定OD450值A.計算殺傷率：殺傷率（%）=[1-（實驗組A值-單獨效應細胞組A值）/單獨靶細胞組A值]×100%.

1.2.5細胞總RNA的提取及cDNA的合成

（1）卡介菌多糖核酸處理CIK細胞：調(diào)整培養(yǎng)至第9天的CIK細胞數(shù)目至2×106 個/mL，于6 孔平底細胞培養(yǎng)板每孔加入細胞懸液1 mL，設實驗組和對照組，實驗組加入卡介菌多糖核酸終濃度為10 mL/L的培養(yǎng)基1 mL，對照組加入生理鹽水，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.

（2）RNA提取及反轉錄：按TRIZOL法提取CIK細胞總RNA，按照Takara反轉錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉錄成cDNA.

1.2.6實時定量PCR

（1）引物的設計與合成：根據(jù)GenBank中基因的序列，查找文獻并用Primer Primer 5 軟件設計CIK相關毒活性因子Granzyme B，TNFα，TNFβ，IFNγ，Actin（內(nèi)參）基因引物（見表1）.將設計好的目的引物序列發(fā)給上海生工公司合成.

（2）引物驗證：引物合成后，加入滅菌水溶解至10 μmol/L.先做一個普通PCR檢測引物是否能克隆出目的片段，PCR反應體系如表2，按照體積從大到小加溶液至總體積為20 μL.

PCR體系加完后用槍輕輕混勻，放入PCR儀擴增片段.擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，重復29個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應完成后產(chǎn)物.

（3）熒光定量PCR：反應體系見表3，共30 μL，具體操作按照Takara SYBR RTqPCR產(chǎn)品說明書進行.

1.2.7統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件及Graphpad軟件進行方差及顯著性分析，檢驗水準（P）設為0.05.

2結果與分析

2.1CIK細胞形態(tài)觀察

CIK細胞即細胞因子誘導的殺傷細胞，它是從人血液分離出來的單核淋巴細胞經(jīng)IL2和CD3單抗等細胞因子誘導培養(yǎng)產(chǎn)生的以CD3+CD56+ T細胞為主的異質細胞群.CIK是一種懸浮細胞，相比癌細胞其體積較小.經(jīng)過適應期的CIK細胞隨著培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量對數(shù)生長且會形成細胞球，細胞體積在7～12 d時有所增大，之后幾乎不變.圖1是顯微鏡下不同時期的CIK細胞形態(tài)，A～D分別對應從人血中分離后培養(yǎng)至1，4，7，11 d的CIK細胞.

2.2卡介菌多糖核酸對CIK細胞增殖的影響

在CIK細胞培養(yǎng)至第7天時，加入不同濃度的卡介菌多糖核酸處理細胞72 h，然后用CCK8試劑盒檢測CIK細胞活性.分析數(shù)據(jù)結果，以不同BCGPSN濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作量效曲線圖，結果如圖2所示.由圖可知，隨著BCGPSN濃度的增加，吸光度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在BCGPSN濃度增加到10 mL/L時，CIK活細胞數(shù)目最多，吸光度最大且明顯高于未加藥組，統(tǒng)計分析差異有意義（*p<0.05）.濃度繼續(xù)增加吸光度反而下降，但仍然比未加藥組高，到200 mL/L時，CIK細胞數(shù)量接近未加藥組.結果說明卡介菌多糖核酸對CIK細胞增殖的影響與劑量依賴有關，低濃度下可促進增殖，高濃度反而無明顯效果.

2.3卡介菌多糖核酸對CIK細胞殺傷活性的影響

為了驗證卡介菌多糖核酸對CIK細胞殺瘤活性有影響，筆者將培養(yǎng)至第9天的CIK細胞加入卡介菌多糖核酸處理72 h（至12 d），再進行CIK殺傷SMMC7721腫瘤細胞實驗.殺傷率統(tǒng)計結果如圖3.結果顯示，無論是實驗組還是對照組，隨著效靶比增大CIK細胞殺傷腫瘤效果增強；相比對照組，實驗組CIK細胞在效靶比為5∶1和10∶1時殺傷率有顯著提高（*p <0.05），在靶效比為20∶1時殺傷率也比對照組稍高.結果說明，卡介菌多糖核酸對CIK細胞殺傷腫瘤細胞的活性有顯著增強作用.

2.4BCGPSN對CIK細胞毒活性相關因子RNA表達的影響

收集生理鹽水和10 mL/L的卡介菌多糖核酸處理72 h的兩組CIK細胞，提取RNA反轉錄成cDNA，做熒光定量PCR檢測CIK細胞毒活性相關因子的表達.瓊脂糖凝膠電泳檢測CIK細胞RNA質量，可看到28S和18S兩條清晰的帶，如圖4.RTqPCR結果顯示BCGPSN實驗組CIK細胞Granzyme B（顆粒酶B），TNFα，TNFβ的mRNA表達量較對照組明顯升高（*p<0.05）， IFNγ的mRNA表達量較對照組也有所升高，如圖5.表明卡介菌多糖核酸的確能促進CIK細胞Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ等mRNA的表達，這可能是BCGPSN增加CIK殺瘤活性的原因之一.

Mark：DNA standard marker；1：對照組CIK細胞RNA；2：BCGPSN實驗組CIK細胞RNA.

3討論

卡介菌多糖核酸是從卡介菌中提取的核酸、多糖等活性物質混合而成的免疫增強劑，具有調(diào)節(jié)機體免疫水平、增強機體抗感染和抗過敏的能力[10]，還可促進T 淋巴細胞的增殖與活化及輔助提高機體內(nèi)NK殺傷活力[11].於敏等[12]研究表明卡介菌多糖核酸能顯著提高斷奶仔豬外周血淋巴細胞分化增殖，推測其可通過直接作用于外周血淋巴細胞從而增強個體免疫力.本研究結果表明低濃度卡介菌多糖核酸可顯著促進體外培養(yǎng)的CIK細胞增殖分化，而在機體免疫應答過程中，T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活、分化、增殖起著重要的作用，因此，卡介菌多糖核酸或可通過直接作用于人周血淋巴細胞從而增強機體免疫力.

卡介菌多糖核酸影響CIK細胞的體外增殖及CIK殺傷肝癌細胞的特點尚無報道.SMMC7721肝癌細胞為本實驗室常用細胞系，材料易得且細胞個體大、生長較快易于實驗，因此在此文中筆者選擇其作為CIK的靶細胞進行殺傷實驗.研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCGPSN處理后的CIK細胞相比對照組殺瘤效果有明顯增加，在效靶比為5∶1和10∶1時殺傷率有顯著提高，在靶效比為20∶1時殺傷率也比對照組稍高，表明卡介菌多糖核酸能提高CIK的殺傷能力.

CIK殺傷腫瘤細胞的具體機制還并不清楚，根據(jù)之前相關的文獻報道，筆者猜測可能與相關毒活性因子的表達相關，于是做熒光定量PCR檢測了實驗組和對照組處理后的CIK細胞Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ的表達，結果發(fā)現(xiàn)這幾類因子的RNA表達水平的確有所提高.Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ這幾種因子在CIK細胞殺瘤過程中發(fā)揮著重要作用，本研究也證實了其RNA表達升高促進了CIK殺瘤效果.為了進一步驗證它們在蛋白水平的表達，后續(xù)將購買TNFα和IFNγ的ELISA試劑盒以檢測其在CIK細胞的胞外分泌情況.

顆粒酶B（Granzyme B）是細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和自然殺傷（NK）細胞顆粒中絲氨酸蛋白酶家族中發(fā)揮殺傷作用的主要效應分子，它能進入靶細胞，激活caspase級聯(lián)反應，迅速引起靶細胞DNA的斷裂，使細胞快速凋亡[13].因此，它是殺傷細胞的標志性分子之一.

腫瘤壞死因子 （Tumor Necrosis Factor， TNF ）是一類重要的細胞因子，包括TNFα和TNFβ兩類，TNFα由巨噬細胞和淋巴細胞分泌產(chǎn)生，而TNFβ則由活化的T細胞分泌[14].TNF具有廣泛的生物學活性，對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用，還能刺激T細胞、B細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞使其功能增強.本研究結果顯示，相比生理鹽水對照組，卡介菌多糖核酸能顯著提高TNFα及TNFβ的mRNA表達量.

γ干擾素（Interferonγ，IFNγ）是I型輔助T細胞（Th1細胞）的標志性細胞因子，能抑制腫瘤細胞分裂，增強巨噬細胞及 NK 細胞的殺傷性.另外γ干擾素還可增加巨噬細胞對抗原的吞噬，調(diào)動機體免疫系統(tǒng)，提高NK細胞對靶細胞的殺傷以及T淋巴細胞和B淋巴細胞的激活，增強機體抗腫瘤免疫應答能力[15].

CIK是目前應用最廣泛的腫瘤過繼免疫治療細胞，因其治療效果與細胞輸注劑量、效應細胞比例和對腫瘤細胞毒性有著密切關系，因此提高其體外的增殖效率和毒性是首要解決的問題.本研究證實低濃度下的卡介菌多糖核酸能促進CIK細胞增殖，又能提高CIK的殺瘤效果，說明卡介菌多糖核酸可以作為一種較好的腫瘤輔助治療藥物.另外CIK細胞殺瘤效率提高的同時相關毒活性因子的表達也增加，揭示其可能是殺傷腫瘤細胞的途徑之一，這也為進一步研究CIK殺傷腫瘤細胞機制奠定基礎，為抗腫瘤過繼免疫治療提供一些新思路.

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（編輯WJ）