倪愛新，岳倩倩，周禮紅*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

紅曲不同溶劑提取物的抗氧化活性

倪愛新1，岳倩倩2，周禮紅2*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

為了研究紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物不同極性部位的體外抗氧化活性，分別用純水、30%乙醇對紅曲進(jìn)行提取，采用有機(jī)溶劑萃取法將30%乙醇提取物分為石油醚相、乙酸乙酯相和2個(gè)水相等不同極性部位，考察其ABTS自由基、DPPH自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的清除效果，比較紅曲提取物不同極性部位的抗氧化作用。結(jié)果表明，紅曲的純水、30%乙醇提取物及其不同極性部位均有抗氧化活性，且與劑量有關(guān)。不同極性部位的抗氧化活性有差異。相同濃度時(shí)，30%乙醇提取物的抗氧化性大于純水提取物的抗氧化性，在濃度10 mg/mL時(shí)，石油醚萃取后的水相的抗脂質(zhì)過氧化性最強(qiáng)，為57.18%，且與其他極性部位具有顯著性差異(P<0.05)，乙酸乙酯相的DPPH自由基清除率最高，為20.66%，乙酸乙酯萃取后水相的ABTS自由基清除率最高，為86.16%，且與其他極性部位具有顯著性差異(P<0.05)。

紅曲；極性；抗氧化活性；提取物；自由基

自由基是需氧細(xì)胞的正常代謝產(chǎn)物，大部分以活性氧(ROS)的形式存在。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的活性氧與抗氧化機(jī)制處于不平衡狀態(tài)時(shí)稱為氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激與癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和炎性疾病等有關(guān)[1]。對此可以攝取一些抗氧化物質(zhì)幫助人體減少這種損傷。開發(fā)利用天然抗氧化劑已成為當(dāng)今食品科學(xué)發(fā)展的趨勢，如天然抗氧化劑在食用油中的應(yīng)用[2]。抗氧化劑的來源有多種，蔡旋等[3]研究發(fā)現(xiàn)微生物源性抗氧化劑與常見抗氧化劑相比，對氧自由基及氮自由基都有較好的清除自由基作用。韓偉等[4]對5株微生物進(jìn)行了體外抗氧化研究，表明具有很好的抗氧化效果。而且單一的微生物如乳酸菌本身就是有效的抗氧化物質(zhì)[5]。微生物所產(chǎn)生的酶系物，如超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶、NADH氧化酶等[6]，具有很高的抗氧化活性，將是替代合成抗氧化劑的最佳選擇之一。

紅曲(Monascus)被用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、天然食用色素、食品防腐劑和膳食補(bǔ)充劑已有幾個(gè)世紀(jì)[7]。目前，在此領(lǐng)域的研究主要集中在新的次級代謝產(chǎn)物的分離和鑒定，以及其生物活性的測定[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)紅曲中的酚類、色素、他汀類等都表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化活性，如從安卡紅曲霉發(fā)酵分離出的Dimerumic acid具有清除自由基的能力[11]?，F(xiàn)已有很多學(xué)者考慮如何進(jìn)一步提高紅曲的抗氧化能力，如在紅曲發(fā)酵中添加大蒜，其發(fā)酵提取物具有抗氧化性和抗腫瘤活性[12]。侯素媛等[13]發(fā)現(xiàn)紅曲與金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)雙向發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗脂質(zhì)過氧化活性。為此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室保藏的紅曲霉在一定條件下發(fā)酵并對其粗提物的抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種紅曲霉菌株3.4777由貴州大學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室選育保藏，藥材金釵石斛莖購自貴州赤水金釵石斛種植基地；抗壞血酸、2-硫代巴比妥酸、七水硫酸亞鐵、乙酸、十二烷基硫酸鈉、正丁醇均為分析純。DPPH(Sigma 公司)，ABTS(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 斜面培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。用于培養(yǎng)紅曲霉菌株。

種子液培養(yǎng)基的制備：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基的制備。將烘干好的金釵石斛粉碎，取50 g粉碎石斛加到800 g米粉中，加入適量水混勻后裝入500 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min，用于紅曲霉固體培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)：將紅曲霉菌株3.457 7接種并在28℃培養(yǎng)7～11 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將斜面上培養(yǎng)好的紅曲霉菌株用無菌吐溫生理鹽水洗下孢子，用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，制成濃度為106個(gè)/mL的均一孢子懸液，吸取5 mL孢子懸液接種到種子液培養(yǎng)基上。在30℃、230 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)3 d得到種子液。將培養(yǎng)好的種子液按10%(v/v)接種到發(fā)酵組培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。

1.2.3 發(fā)酵紅曲米的粗提取 純水粗提取：取12 g發(fā)酵樣品，加180 mL純水至于250 mL三角瓶中，密封，60℃水浴提取12 h。次日對提取液進(jìn)行抽濾、減壓旋蒸。自然揮干后得到粗提物A。

30%乙醇提?。喊醇兯痔崛》椒ㄒ?0%乙醇為提取劑進(jìn)行提取，得到自然揮干產(chǎn)物B。

粗提取物的萃?。喝軇┦兔演腿〈痔嵛铮喊l(fā)酵紅曲米按30%乙醇提取提取抽濾，取抽濾液用石油醚進(jìn)行3次萃取，3次上層的萃取液與3次下層的浸提液分別合并后在低于60℃下減壓旋干，使溶劑自然揮干，得到剩余浸提物C和石油醚萃取物D。

溶劑乙酸乙酯萃取粗提物：取上述石油醚萃取得到的下層浸提液用溶劑乙酸乙酯進(jìn)行3次萃取，3次上層的萃取液與3次下層的浸提液分別合并后在低于60℃下減壓旋干，自然揮干，得到剩余浸提物E和乙酸乙酯萃取物F。

1.2.4 抗氧化活性檢測樣品的制備 紅曲米檢測樣品的制備：分別稱取上述樣品A、B、C、D、E、F 0.25 g，用相應(yīng)的溶劑溶解后定容至25 mL，此溶液的質(zhì)量濃度為10 mg/mL。吸取適量10 mg/mL的溶液分別用相應(yīng)溶劑稀釋一倍得到質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。將各溶液12 000 r/min，離心15 min，取上清液。將上清液過微孔濾膜，得到待檢測液。

VC組檢測樣品的制備：稱取0.125 g VC用蒸餾水溶解，定容至25 mL，得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的對照組。

1.2.5 抗脂質(zhì)過氧化能力的測定 采用曾維才等[14]的方法測定各樣品的抗脂質(zhì)過氧化率。

脂質(zhì)過氧化抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白組吸光度)×100%

式中：A空白組指以0.1 mL相應(yīng)溶劑代替樣品測得的吸光度。

1.2.6 清除DPPH自由基活性的測定[15]量取50 μL試樣分別加入1 ml的DPPH(1 mmol/L，乙醇為溶劑)，0.95 mL Tris-Hcl緩沖液(0.05 mol/L，PH為7.4)，1 mL乙醇混合后避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度。

清除率(%)=(A空白組-A實(shí)驗(yàn)組)/A空白組×100%

式中：A空白組指以50 μL相應(yīng)溶劑代替樣品測得的吸光度值。

1.2.7 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)的測定 根據(jù)肖翔等[16]的方法并稍作修改。將5 mL的ABTS(7 mmol/L)和5 mL的K2S2O8(2.45 mmol/L)溶液充分混合，在室溫、避光條件下靜置過夜(12～16 h)，得到ABTS+儲(chǔ)備液。將ABTS+儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋，用紫外分光光度計(jì)測量，使其在波長734 nm處的吸光度值為0.700±0.002，得到ABTS+工作液。取30 μL樣品與3.0 mL ABTS+工作液混合，充分反應(yīng)15 min，常溫條件下在波長734 nm處測定吸光度值。

清除率(%)=(A空白組-A實(shí)驗(yàn)組)/A空白組×100%

式中：A空白組指以30 μL相應(yīng)溶劑代替樣品測得的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物各極性部分的抗脂質(zhì)過氧化作用

抗脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪窍蚍磻?yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，氧化分解的丙二醛及其類似物與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成粉紅色產(chǎn)物減少，反應(yīng)溶液吸光度發(fā)生改變。吸光度降低越多，抑制率越高，表明受試物的抗氧化活性越強(qiáng)。由圖1可以看出紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物不同極性部位均表現(xiàn)出不同程度的抗脂質(zhì)過氧化的能力。在相同的濃度，以30%乙醇提取物的脂質(zhì)抗氧化能力最強(qiáng)為62.36%(10 mg/mL)、49.42%(5 mg/mL)，與其他的抗脂質(zhì)過氧化率均具有顯著差異(P<0.05)，石油醚相的最小為18.96%(10 mg/mL)、8.62%(5 mg/mL)。并且每一相的抗脂質(zhì)過氧化的能力與加入的提取物的濃度有關(guān)，濃度增加，抑制率提高，如圖1所示。

圖1 不同極性提取物的抗脂質(zhì)過氧化Fig.1 Inhibiting lipid peroxidation of different polar extracts

A：純水提取物；B：30%乙醇提取物； C：石油醚提取后的水相(水相1)；D：石油醚相； E：乙酸乙酯提取后的水相(水相2) ；F：乙酸乙酯相； G：維生素C

2.2 紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物中各極性部分對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，導(dǎo)致溶液顏色變淺，在517 nm處的吸光度變小則表明受試物具有降低羥自由基、烷基自由基或過氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈的作用[17]。

如圖2所示紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物不同極性部位對DPPH自由基均有清除能力，但是都不高，且與提取物的濃度有關(guān)，濃度增加，清除率提高。在濃度為10 mg/mL時(shí)，它們的DPPH自由基清除能力大小依次為30%乙醇>乙酸乙酯相>水相1>水相2>純水>石油醚相，且30%乙醇與乙酸乙酯相之間差異顯著性(P>0.05)，如圖2所示。

圖2 不同極性提取物的DPPH清除活性Fig.2 Scavenging DPPH radical activities of different polar extracts

A：純水提取物；B：30%乙醇提取物；C：石油醚提取后的(水相1)；D：石油醚相； E：乙酸乙酯提取后的水相(水相2)； F：乙酸乙酯相；G：維生素C

2.3 紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物中不同極性部分對ABTS自由基清除率的測定

ABTS與一定濃度的過硫酸鉀避光反應(yīng)12～16 h，經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+·。若提取物具有抗氧化活性，則會(huì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色[17]。由圖3可以看出，6種不同極性萃取物均具有清除ABTS+·能力且有差異，為其清除自由基或發(fā)揮抗氧化作用奠定了基礎(chǔ)。各極性部位的ABTS+·清除力大小依次為：水相2>水相1>30%乙醇>純水>乙酸乙酯相>石油醚相。水相2與水相1的ABTS+·清除力較大且顯著大于其他相的(P<0.05)。

圖3 不同極性提取物的ABTS自由基清除活性Fig.3 Scavenging ABTS radical activities of different polar extracts

A：純水提取物；B：30%乙醇提取物；C：石油醚提取后的水相(水相1)；D：石油醚相；E：乙酸乙酯提取后的水相(水相2)；F：乙酸乙酯相；G：維生素C

3 結(jié)論與討論

紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物中各極性部分均有一定的抗氧化性表明各極性部分均有一定量的抗氧化活性物，這為紅曲作為抗氧化物質(zhì)應(yīng)用于食品來幫助人們減少氧化損傷和微生物源抗氧化物的開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。石油醚萃取后的水相抗脂質(zhì)過氧化性最強(qiáng)，乙酸乙酯相的DPPH自由基清除率最高，乙酸乙酯萃取后水相的ABTS自由基清除率最高，這與所含活性物質(zhì)的含量有關(guān)。

濃度為10 mg/mL時(shí)，在抑制脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)抗氧化活性能力為：30%乙醇>水相1>水相2>純水>乙酸乙酯相>石油醚相，在DPPH自由基的清除能力實(shí)驗(yàn)中，抗氧化活性次序?yàn)椋?0%乙醇>乙酸乙酯相>水相1>水相2>純水>石油醚相，在對ABTS自由基清除率的測定中，抗氧化能力為：水相2>水相1>30%乙醇>純水>乙酸乙酯相>石油醚相，表明相同極性部位的提取物，在不同的抗氧化體系中，其抗氧化能力也不同，在相同的抗氧化體系中，相同極性部位的提取物的抗氧化能力也存在不同，這與提取物的不同極性部位中所含主要抗氧化成分的含量、種類和結(jié)構(gòu)有關(guān)，在不同的抗氧化體系中，提取物的不同極性部位的抗氧化作用不同，其對不同類型的自由基有選擇性作用。在本實(shí)驗(yàn)中石油醚相與水相1的抗氧化性總和大于30%乙醇提取物的抗氧化活性，乙酸乙酯相與水相2的抗氧化性總和大于水相2的，可能是在總物質(zhì)濃度相同時(shí)，30%乙醇與水相1中抗氧化活性物質(zhì)純度低，從而降低了抗氧化活性。在本實(shí)驗(yàn)中可以看出紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物提取物中各極性部分的抗氧化性與濃度有關(guān)，但未做深入探索，還需進(jìn)一步研究。

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Antioxidant activity of different solvent extracts fromMonascus

NIAi-xin1，YUEQian-qian2，ZHOULi-hong2*

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China; 2.CollegeofLifeSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

In order to investigate the in vitro antioxidant activity of different polarity parts of extract fromMonascus， the yeast was extracted with pure water and 30% ethanol respectively. Extracts from 30% ethanol were divided by organic solvents into petroleum ether phase， ethyl acetate phase and two aqueous phases of different polarity parts. The removal effects of ABTS free radical， DPPH free radical and lipid peroxidation product， the malondialdehyde (MDA)， were investigated. The antioxidant effects of different polarity parts of Monascus extracts were compared. The results showed that extracts of pure water， 30% ethanol and different polarity parts from Monascus were all observed to have antioxidant activities， and the activities are related to the extract concentration. The antioxidant activity of different polar parts is different. Under the same concentration， the antioxidant activities of 30% ethanol extract are greater than pure water extract. Under the concentration of 10 mg/mL， the extracts of aqueous phase extracted by petroleum ether had the strongest anti-lipoperoxidation inhibition ratio of 57.18%， and is significantly different from other polarity parts (P<0.05); the extracts of ethyl acetate phase had the strongest DPPH free radical ratio of 20.66%; the extracts of aqueous phase extracted by ethyl acetate had the strongest ABTS free radical ratio of 86.16% and is significantly different from other polarity parts (P<0.05).

Monascus；polarity; antioxidant activity; extract; free radical

2016-09-28；

2016-12-28

國家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD331306)。

Q939.9

A

1008-0457(2017)01-0082-04 國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.016

*通訊作者：周禮紅(1976-)，女，博士，副教授，主要研究方向：微生物應(yīng)用；E-mail：lhzhou33@126.com。