史資，陳新，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

DPPH法測定茄葉斑鳩菊不同極性部位的抗氧化活性

史資，陳新*，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

通過萃取手段將植物分為不同極性部位，并利用DPPH法研究茄葉斑鳩菊不同極性部位的抗氧化活性。通過試驗研究表明，不同極性部位都具有一定的抗氧化能力，且在相同濃度的條件下，氯仿層浸膏、乙酸乙酯層浸膏、正丁醇層浸膏、總提物、石油醚層浸膏所表現(xiàn)出的抗氧化能力依次減弱，且氯仿層和乙酸乙酯層浸膏抗氧化能力突出，具有開發(fā)價值。

茄葉斑鳩菊；不同極性部位；DPPH；抗氧化活性

茄葉斑鳩菊（Vernonia solanifolia Benth）為菊科（Compositae）斑鳩菊屬（Vernonia）植物的一種，該植物主要產(chǎn)地分布于國內(nèi)的南方地區(qū)、東南亞、南亞等地。迄今為止，自斑鳩菊屬植物中分離出的化學(xué)成分種類較多，生物活性多樣，包括甾體、萜類、黃酮類、苯丙素類、脂肪酸等[1]。藥理學(xué)研究表明，其藥理活性主要集中在抗腫瘤、免疫和抗感染活性[2-4]，目前國內(nèi)對斑鳩菊屬植物的抗腫瘤活性成分研究較多，有些研究已在藥品、食品及工業(yè)等領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。而對于其抗氧化活性研究較少，楊丹等[5]對叉枝斑鳩菊中低極性成分及不同萃取部分做了抗氧化活性測試，并證實了正丁醇部位具有一定的抗氧化活性。本次試驗以維生素C作為陽性對照[6]，應(yīng)用DPPH[7]法研究茄葉斑鳩菊的不同極性部位抗氧化活性能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茄葉斑鳩菊（Vernonia solanifolia Benth）：采于福建省，經(jīng)鑒定為菊科（Compositae）斑鳩菊屬（Vernonia）全株植物；DPPH：凱瑪生化（天津）有限公司；甲醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；真空干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；粉粹機：天津市泰斯特儀器有限公司；100 μL～1 000 μL、1 mL～5 mL移液槍：上海泰坦科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 各極性部位樣品制備

取曬干后的茄葉斑鳩菊500 g，粉粹成粗粉，用2 L甲醇超聲輔助提取3次，浸提液抽濾合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收甲醇，得到總浸膏，取出少量總浸膏作為總提物樣品，再將剩余總浸膏用適量水分散，得混懸液，再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并各萃取液減壓濃縮得到各部位浸膏，再放入真空干燥箱中干燥24 h后備用。

1.3.2 DPPH溶液的配制

精密稱取DPPH 10.1 mg，甲醇溶解，定容至25 mL，再吸取10 mL定容至100 mL容量瓶中得到濃度為40.4 mg/L DPPH儲備液。

1.3.3 陽性對照組VC原溶液制備

精密稱取VC10 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶，得到濃度為1 mg/mL的VC原溶液。

1.3.4 各極性樣品原液的配制

取各極性部位樣品50 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的樣品原液。

1.3.5 不同濃度的試驗樣品液準(zhǔn)備

1.3.5.1 不同濃度的VC溶液配制

分別精密吸取VC原溶液0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得到濃度為0.001、0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02 mg/mL的VC樣品液。

1.3.5.2 不同濃度的各極性部位樣品液配制

分別吸取各極性樣品原液0.04、0.08、0.12、0.2、0.4、0.8、1.2、1.8 mL，甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，得到濃度為0.02、0.04、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6、0.9 mg/mL的樣品液。

1.3.6 各樣品溶液與DPPH溶液反應(yīng)時間的確定

由于許多抗氧化劑與DPPH自由基的反應(yīng)動力學(xué)不同，或者甚至不反應(yīng)，所以，物質(zhì)與DPPH自由基的反應(yīng)達到平衡所用時間不同，因此，針對于不同原料，需要測定其達到反應(yīng)平衡所需要的時間[8]。

以濃度為0.9 mg/mL的各極性部位樣品液為參考，各吸取2 mL樣品液與2 mL DPPH溶液混合均勻，以517 nm為測定波長[9]，每隔2 min測一次吸光度，記錄數(shù)值，直到吸光度趨于穩(wěn)定為止，將吸光度值與時間的關(guān)系做一曲線，見圖1。

圖1 各極性部位樣品液吸光度隨時間變化的曲線Fig.1Absorbance curve of different polar parts changes over time

由圖1可知，不同極性部位樣品液加入到DPPH溶液后，吸光度值在0～30 min內(nèi)，變化較為明顯，在30 min～40 min之間，變化趨勢趨于穩(wěn)定，為了使反應(yīng)充分，測得數(shù)據(jù)更可靠，所以將反應(yīng)時間確定為40 min。

1.3.7 樣品液對DPPH自由基清除率的測定方法

以517 nm為測定波長，以甲醇為參照調(diào)零，先精密吸取2 mL DPPH溶液與2 mL甲醇混合均勻，用紫外-分光光度計測定吸光度，記為A0，再分別量取不同濃度的VC樣品液及不同極性部位的樣品液2 mL與2 mL甲醇混合均勻，用紫外-分光光度計測各混合液的吸光度，記為Aj，最后吸取不同濃度的VC樣品液和不同極性部位的樣品液2 mL與2 mL DPPH溶液混合均勻，靜置40 min后測定吸光度，記為Ai，每組數(shù)據(jù)平行測定2次取平均值后代入公式計算清除率（SR）%。

2 結(jié)果與分析

2.1 各極性部位對自由基清除率結(jié)果

各極性部位對自由基清除率結(jié)果見表1。

表1 各極性部位對自由基清除率Table 1Free radical scavenging rate of different polar parts

2.2 各極性部位不同濃度下的清除率曲線

根據(jù)表1測得的數(shù)據(jù)，制作各極性部位不同濃度下的清除率曲線，見圖2。

圖2 各極性部位不同濃度下的清除率曲線Fig.2Clearance rate curve of different polar parts under different concentrations

從圖2所顯示的趨勢得知，不同極性部位對DPPH自由基的清除效果有差異，各極性部位濃度在0～0.2 mg/mL之間，變化明顯，且具有一定的線性關(guān)系，濃度在0.2 mg/mL～0.9 mg/mL之間，變化趨勢放緩。并且在同一濃度下，各部位表現(xiàn)出的清除自由基能力大小為氯仿＞乙酸乙酯＞正丁醇＞總提物＞石油醚，且氯仿和乙酸乙酯部位作用更明顯，濃度在0.2 mg/mL的情況下，清除率分別達到83.96%、78.74%。

2.3 VC樣品液清除率曲線

根據(jù)1.3.7測得的VC樣品清除率數(shù)據(jù)，繪制清除率曲線，見圖3。

圖3 不同濃度的VC樣品液清除率曲線Fig.3Clearance rate curve of VCsamples with different concentrations

由圖3可知，不同濃度的VC樣品液在較低濃度下線性關(guān)系較好，表現(xiàn)出的對自由基的清除率較高，可用于與植物提取物的對照當(dāng)中。

3 結(jié)論與討論

通過試驗得出，氯仿和乙酸乙酯部位清除自由基能力明顯高于其他部位，濃度在0.9 mg/mL時，清除率分別達到98.05%、97.62%。和圖3中VC相比，雖然在同濃度下，VC表現(xiàn)出的抗氧化能力強于氯仿和乙酸乙酯部位，但是這兩個部位還處在粗提階段，相對于VC而言，抗氧化成分所占百分比較小，今后這兩個部位可以進一步提純，純化抗氧化活性成分，開發(fā)出一種天然抗氧化劑。針對于此種植物的抗氧化活性研究尚屬第一次，且效果較好，為以后開發(fā)其抗氧化產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）法是一種常用的體外評價和篩選物質(zhì)抗氧化活性的方法，具有技術(shù)成熟、重現(xiàn)性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點[10]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于自由基清除能力的分析中。

利用DPPH溶液的深紫色吸光度變化作為清除自由基能力的分光光度測定[11]。在試驗過程中，觀察到不同濃度的樣品溶液加入到DPPH溶液中，溶液的深紫色由低濃度到高濃度逐漸變淺，在較高濃度下，溶液呈黃色溶液，測得的吸光度值也逐漸變小，這一現(xiàn)象符合理論事實。

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Antioxidant Capacity of Different Polar Parts from the Vemonia solanifolia Benth by DPPH Method

SHI Zi，CHEN Xin*，LIU Liang
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The plants are divided into different polar parts by means of extraction，and to study the antioxidant activity of different polar parts from the Vemonia solanifolia Benth with the method of DPPH.The experimental study shows that different polar parts have certain antioxidant ability，and under the condition of the same concentration，chloroform extract and ethyl acetate layer extract，n-butanol extract，total extract，petroleum ether extract showed the antioxidant capacity decreased in turn，and chloroform and ethyl acetate extract antioxidant capacity is outstanding，it has the development value.

Vernonia solanifolia Benth；different polar parts；DPPH；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.005

2016-09-06

國家自然科學(xué)基金項目（31370369）

史資（1990—），男（漢），在讀碩士，研究方向：天然活性成分研究與開發(fā)。

*通信作者：陳新（1978—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品功能成分研究與開發(fā)。