汪培勤+++湯菊妹++王健容++唐艷麗++郭錦錦++孫萬邦

[摘要]目的 通過檢測兒童接種后遠期血清抗體水平和T細胞亞群分泌細胞因子，評價其體液免疫持久性及其對細胞免疫功能的影響。方法 2013年1月～2015年7月在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院兒童保健科體檢的兒童，篩選麻疹疫苗接種的兒童32名，接種時間為3～10年，取外周血2 ml分離血清，用ELISA法檢測麻疹抗體；根據(jù)麻疹抗體水平檢測結果將所有受試者分組，即低應答組（9.00～19.99 IU/L）、中應答組（20.00～199.99 IU/L）和高應答組（200.00～320.00 IU/L）；將麻疹疫苗接種的32例兒童血液標本分離的外周血單個核細胞（PBMC）進行培養(yǎng)，培養(yǎng)中設計不加麻疹疫苗的對照組、加疫苗刺激的實驗組。用細胞因子微球檢測技術檢測細胞培養(yǎng)上清液中Th1細胞因子TNF-α和Th2細胞因子IL-10。結果 抗體陽性率為81.2%，抗體水平為（115.03±95.20）IU/L；高應答組抗體水平顯著高于中應答組和低應答組（P<0.05）；實驗組和對照組因子水平的中位數(shù)分別2021.81 pg/ml（TNF-α）、2566.93 pg/ml（IL-10）和1481.72 pg/ml（TNF-α）、1861.89 pg/ml（IL-10），實驗組的TNF-α和IL-10水平顯著高于對照組（P<0.05）。結論 兒童麻疹疫苗接種后抗體陽性率較高，且接種后體內存在免疫記憶性T細胞，在接觸抗原刺激后可介導細胞免疫應答。

[關鍵詞]麻疹疫苗；抗體；細胞因子；遠期免疫；免疫記憶

[中圖分類號] R725.111 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（b）-0004-05

Antibody levels and the secreting characterization of Th1/Th2 cytokines in the children long term after vaccination with measles vaccine

WANG Pei-qin1 TANG Ju-mei1 WANG Jian-rong1 TANG Yan-li1 GUO Jin-jin2 SUN Wan-bang2▲

1.Department of Pediatrics，Shenzhen Longgang Maternal and Child Health Care Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518172，China；2.Immunology Teaching and Research Section，Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Guangdong Province，Zhuhai 519041，China

[Abstract]Objective To detect the serum antibody level and cytokine secretion of T cell subsets in children after vaccination，and to evaluate the effect of humoral immunity and cellular immunity.Methods A total of 32 children with measles vaccination for 3-10 years were selected in Children′s Health Care Department of Longgang District Maternal and Child Health Care Hospital of Shenzhen from January 2013 to July 2015. 2 ml blood samplewas used for measure measles antibody titers by ELISA from isolated serum，who were divided into low response group （9.00-19.99 IU/L），middle response group （20.00-199.99 IU/L） and high response group （200.00-320.00 IU/L） according to the results of measles antibody levels.The peripheral blood mononuclear cells （PBMC） were isolated from the other 3 ml blood sample.The experimental group，stimulated by measles vaccine （3.0 μg/ml） and control group were set，without stimulation.Both groups were cultured and taken to detect TNF-α and IL-10 by Cytometric Bead Array （CBA）.Results The positive rate of antibody was 81.2%，of which the level was （115.03±95.20） IU/L.The antibody level in the high response group was significantly higher than those in the medium response group and low response group （P<0.05）.The medians of factors in the experimental group and control group were respectively 2021.81 pg/ml （TNF-α），2566.93 pg/ml （IL-10） and 1481.72 pg/ml （TNF-α），1861.89 pg/ml （IL-10），and the TNF-α and IL-10 levels in the experimental group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）.Conclusion Thepositive rate of antibody is high in children after vaccination with measles vaccine，and there are immune memory T cells，which can mediate cell-mediated immune response when exposure to antigen stimulation.

[Key words]Measles vaccine；Antibody；Cytokine；Long-term effect；Immunological memory

麻疹（measles vaccine，MV）是幼兒時期常見的急性呼吸道傳染病，主要由麻疹病毒感染所致傳染性極強。肺炎、腦炎等均是麻疹麻疹患兒常見并發(fā)癥，也是導致病死率居高不下的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，截止19世紀90年代，全球約有4000萬麻疹病例，約有100萬死亡，較麻疹疫苗接種前顯著降低[1]。我國于2006年參考WHO建議，提出綜合性消除麻疹策略，該策略中將兒童常規(guī)免疫干預作為基礎，并鼓勵強化麻疹疫苗免疫處理，旨在提高幼兒群體的機體抵抗能力[2]。此后我國麻疹發(fā)病率降至2012年的最低點接近4.5/100萬，但從2013年開始又明顯回升，至2015年的發(fā)病率接近38/100萬，死亡人數(shù)也從2012年的8人升至2015年的32人[3]，未能達到世界衛(wèi)生大會確定的目標，即截至2015麻疹發(fā)病率<5/100萬[4]。近年的麻疹病例除兒童外，也有成人麻疹病例[5-6]。因此，對于麻疹疫苗接種后的遠期免疫效果有必要重新認識。既往關于兒童麻疹疫苗接種的研究中，大多著重于抗體水平檢測以及近遠期效果觀察，關于對記憶免疫細胞功能檢測評價接種效果的切入點研究尚鮮有報道。鑒于此，本研究特對麻疹疫苗接種的兒童進行基于記憶免疫細胞功能水平的檢測研究，從免疫記憶的角度來評價接種麻疹疫苗后的遠期效果。

1資料與方法

1.1一般資料

從2013年1月～2015年7月在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院兒童保健科體檢的兒童，篩選接種過麻疹疫苗的兒童32名作為受試對象，其中男性18名，女性14名，年齡7～10歲，平均年齡（8.3±1.0）歲。入選標準：末次接種麻疹疫苗后時間為3年以上，家長均知情同意者；排除標準：有麻疹病史，合并有其他類型嚴重系統(tǒng)性疾病者，存在有免疫系統(tǒng)缺陷疾病者。本研究符合醫(yī)院醫(yī)學倫理條件。根據(jù)麻疹抗體水平檢測結果將所有受試者分組，即低應答組（10例，9.00～19.99 IU/L）、中應答組（8例，20.00～199.99 IU/L）和高應答組（14例，200.00～320.00 IU/L）。低應答組中男性6例，女性4例；年齡7～10歲，平均年齡（8.6±1.3）歲。中應答組中男性5例，女性3例；年齡7～10歲，平均（8.5±1.2）歲。高應答組中男性7例，女性7例；年齡7～10歲，平均（8.6±1.2）歲。三組間一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 麻疹病毒（MV Ab）ELISA試劑盒由深圳晶美生物科技公司提供；TNF-α CBA、IL-10 CBA試劑盒均由美國Becton Dickinson公司提供；胎牛血清、改良型RPMI-1640培養(yǎng)液均由寶生物（大連）公司提供；麻疹減毒活疫苗購自上海生物制品研究所；CO2培養(yǎng)箱購自美國RAD公司；流式細胞儀（FACS Calibur型）購置美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.2分組方法 將麻疹疫苗接種的32例兒童血液標本分離的PBMC進行培養(yǎng)，培養(yǎng)中設計不加麻疹疫苗為對照組，加疫苗刺激為實驗組。

1.2.3檢測方法 標本無菌采受試者靜脈血5 ml，分裝。其中2 ml自然凝固，并離心分離，取上清液用測麻疹抗體水平，所用方法為ELISA，分離血清后，參照說明書步驟測得標準品的OD值及樣品OD值，然后計算出標準曲線回歸方程，可將OD值代入上述方程中，從而得出樣品濃度；另3 ml置于抗凝管中，于5 min后加入3 ml D'Hank's液。搖晃均勻后向其中加入2 ml淋巴細胞分離液，離心，并對淋巴細胞實施洗滌處理。加2 ml培養(yǎng)液，離心分離，取沉淀細胞，調整淋巴細胞，使其濃度達細胞數(shù)1×106/ml。將上述樣品加入96孔培養(yǎng)板中，每孔樣品量為100 μl。每組設置3個復孔，其中實驗組加入濃度為3.0 μg/ml的麻疹疫苗；對照組則加等量無菌生理鹽水，并于每孔中加入100 μl濃度為10%的培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中（濃度為5%），培養(yǎng)條件：37℃，50 h。取上述樣品離心分離，轉速為800 r/min，處理時間為5 min。用流式CBA法檢測細胞因子操作步驟參照說明書制作標準品與待測樣本，BD-FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞因子TNF-α、IL-10。收集完畢后，用FCAP Array v1.0軟件繪制標準曲線并分析數(shù)據(jù)。

1.3觀察指標

觀察本組患兒血清麻疹抗體濃度、不同組間血清麻疹抗體水平高低檢測結果、接種麻疹疫苗不同時間抗體水平結果、接種麻疹疫苗不同次數(shù)的抗體檢測結果、實驗組和對照組麻疹疫苗接種兒童TNF-α和IL-10水平檢測結果。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，不服從符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)改用中位數(shù)表示，兩組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1血清檢測結果

血清檢測的麻疹抗體結果為符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，結果顯示：在9.00～320.00 IU/L區(qū)間內均能檢測到麻疹病毒抗體，但抗體水平差異較大，抗體水平為（115.03±95.20）IU/L（圖1）。

2.2不同組間抗體水平檢測結果

32例受試者均檢出抗體，低應答組濃度為（18.49±1.09）IU/L，中應答組濃度為（92.40±59.31）IU/L，高應答組濃度為（259.25±32.60）IU/L，分組比較結果顯示，高應答組抗體水平高于低應答組及中應答組（P<0.05），其中抗體陽性率為81.2%（圖2）。

與高應答組比較，▲P<0.05

圖2 不同血清抗體的濃度比較

2.3接種麻疹疫苗不同時間抗體水平結果

為了觀察32例兒童接種麻疹疫苗后不同時間抗體水平變化，根據(jù)接種時間分組，最后1次接種后持續(xù)時間3～6年的抗體濃度為（128.12±93.94）IU/L，持續(xù)時間7～8年的抗體濃度為（89.29±76.47）IU/L，持續(xù)時間9～10年的抗體濃度為（134.01±123.46）IU/L，結果顯示組間差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）（圖3）。

2.4接種麻疹疫苗不同次數(shù)的抗體檢測結果

為了觀察麻疹疫苗接種次數(shù)抗體水平的情況，根據(jù)對象接種疫苗的次數(shù)不同進行分組，單次組抗體濃度為（126.82±113.71）IU/L，多次（2～4次）組抗體濃度為（101.68±70.23）IU/L，對組間抗體水平再進行分析，結果顯示：單次接種與多次接種麻疹疫苗的抗體水平無明顯差異（P>0.05）（圖4）。

2.5麻疹疫苗接種兒童TNF-α檢測結果

結果為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析顯示在麻疹疫苗刺激的實驗組的TNF-α中位數(shù)為2021.81 pg/ml，對照組的中位數(shù)為1481.72 pg/ml，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示PBMC在接受麻疹疫苗刺激后產(chǎn)生Th1細胞因子TNF-α明顯增高；與對照組比較，中應答組、高應答組均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.6麻疹疫苗接種兒童IL-10檢測結果

結果為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析顯示在麻疹疫苗刺激的實驗組的IL-10中位數(shù)為2566.93 pg/ml，明顯高于對照組的1861.89 pg/ml（P<0.05），提示麻疹疫苗接種兒童的PBMC在接受麻疹疫苗刺激后產(chǎn)生的Th2細胞因子IL-10明顯增高；與對照組比較，低應答組、中應答組、高應答組均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

表2 流式CBA法檢測培養(yǎng)液IL-10結果（pg/ml，中位數(shù)）

與對照組比較，aP<0.05

3討論

麻疹病毒屬副黏病毒科，為單股負鏈RNA病毒。麻疹病毒感染后，機體內細胞及體液免疫均可參與免疫應答，從而使得炎癥因子水平異常升高。此外，因麻疹病毒為細胞內感染，在清除病毒方面，細胞免疫起重要作用。人免疫系統(tǒng)存在免疫記憶，免疫記憶是免疫接種策略研究的基礎[7]。麻疹疫苗為減毒活疫苗，接種后適應性體液免疫應答主要由B淋巴細胞所介導，B細胞接受抗原刺激后，在Th細胞的輔助下，可在出現(xiàn)活化、增殖的同時產(chǎn)生漿細胞分泌特異性抗體或分化成為記憶性B細胞。在抗原清除后，由于存在免疫記憶，體內仍會持續(xù)維持麻疹保護性抗體分泌[8-9]，故通過檢測抗體可評估其免疫效果。本實驗抗體檢測結果陽性率為81.4%，陽性率較高，這與劉東磊等[10-11]的研究結果近似，而Knuf等[12]報導麻疹疫苗接種3年后的抗體陽性率達98.5%，甚至Davidkin等[13]隨訪麻疹疫苗接種20年后抗體陽性率仍達95%，提示接種麻疹疫苗后遠期仍有較高的保護性抗體水平。本研究根據(jù)研究對象未次接種麻疹疫苗后年份的不同進行分析，也未發(fā)現(xiàn)抗體水平會隨接種后時間的推移而出現(xiàn)下降。同時觀察到多次接種與單次接種的兒童健康志愿者間血清抗體水平并無明顯差異，說明麻疹疫苗多次接種可能并不能提升接種者體內麻疹抗體水平。

麻疹疫苗接種后細胞免疫主要由T淋巴細胞介導，T細胞通過細胞膜表面的T細胞受體（TCR）特異性識別抗原，通過信號轉導活化、增殖并分化成為效應性T細胞或記憶性T細胞[14]。記憶性T細胞可分為效應型記憶性T細胞（TEM）和中央型記憶T細胞（TCM）。其中前者的細胞毒潛力較高，一旦接收到抗原的刺激，將會迅速合成效應分子；而后者細胞毒潛力較低，但是增殖潛力較高，一旦接觸到同種抗原，將會在短時間內大量增殖，并且在產(chǎn)生效應細胞的同時分泌具有多種生物學功能的效應因子[15]。研究顯示[16]，CD8+T細胞能清除細胞內感染的病原，并且還可以對感染的細胞產(chǎn)生直接殺傷作用，也可通過釋放細胞因子達到理想的殺傷感染細胞的效果，進而阻斷麻疹病毒復制和增殖。但是該細胞的產(chǎn)生及其功能的維持往往需要CD8+T細胞的輔助，而二者均受控于調節(jié)性T細胞。CD4+T細胞在細胞免疫應答中是重要的效應細胞[17-18]，CD4+T細胞中Th1和Th2細胞兩個功能亞群分泌的細胞因子不同，Th1細胞可分泌多種與遲發(fā)型超敏反應T細胞及TCL細胞成熟、增殖和分化相關的細胞因子，如IFN-γ和TNF-α等。由此可知，介導細胞免疫應答是此類細胞的主要生理學功能，能夠發(fā)揮重要的抵抗細胞內病原體感染的作用。另有研究顯示[19-20]，Th2細胞可分泌與B細胞成熟、增殖和分化等密切相關的細胞因子，進而促使生成抗體，介導并提高體液免疫應答反應。本研究檢測Th1細胞因子TNF-α及Th2細胞因子IL-10時，發(fā)現(xiàn)實驗組明顯較對照組增高，表明麻疹疫苗的刺激使機體迅速產(chǎn)生效應因子，提示機體內存在免疫記憶。TNF-α在抗病毒方面扮演著重要的角色，通過與靶細胞TNF受體結合，干擾病毒復制和誘導細胞凋亡[21-22]，IL-10具有多種免疫功能，它在病毒等感染過程中主要行使免疫調節(jié)功能[23]，它可以同時抑制Th1和Th2細胞產(chǎn)生多種因子，對CD4+T細胞的增殖及具有多種生物學功能和效應的細胞因子的合成也有不同程度的抑制作用。此外，IL-10對淋巴細胞中增殖也有一定的抑制作用[24]。本研究中實驗組IL-10明顯增高，提示Th2也明顯活化、增殖并分化效應性T細胞，對Th1細胞相關的因子的分泌產(chǎn)生調節(jié)和抑制作用，以免機體發(fā)生過度炎癥反應甚至造成組織細胞過度損傷。另一方面，該物質還可對B細胞增殖轉化產(chǎn)生促進作用，促使B細胞分化為漿細胞，從而能夠保證合成和分泌更多的抗體，充分發(fā)揮其保護性作用。Th1/Th2細胞因子的高分泌從因子水平上表明麻疹疫苗接種的高效性，提示麻疹疫苗接種能促使機體產(chǎn)生對于麻疹病毒的免疫記憶。最后，高應答組的抗體分泌水平遠遠高于低應答組和中應答組，證實在麻疹疫苗接種的兒童機體中抗體水平高者再次接觸抗原后，能夠更為迅速地產(chǎn)生能力更強的效應因子。

綜上所述，麻疹疫苗接種后的高保護性抗體陽性率以及疫苗刺激后Th1/Th2細胞因子分泌表明免疫記憶狀態(tài)。盡管我國麻疹疫苗接種主要實行計劃免疫，但是仍然存在較多沒有接種麻疹疫苗的兒童。為早日實現(xiàn)WHO確立的目標（至2020年消除麻疹）[4]，應該強化免疫，保證全面覆蓋。目前仍存在麻疹疫苗接種后再感染的情況，甚至有成人感染的現(xiàn)象，推測其中原因可能為接種后部分人群因免疫力比較低；也可能與有些個體的遺傳易感性有關或者可能存在對當前麻疹疫苗無反應的基因，這個課題也是值得我們深入研究的方向。

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（收稿日期：2017-02-08 本文編輯：任 念）