高玉榮，崔素萍，徐國(guó)棟，李大鵬，張麗媛，王欣

Garviecin LG34抗菌機(jī)理研究

高玉榮，崔素萍，徐國(guó)棟，李大鵬，張麗媛，王欣

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究了細(xì)菌素Garviecin LG34對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌機(jī)理。結(jié)果表明，Garviecin LG34導(dǎo)致金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)的K+及260 nm和280 nm處紫外吸收物質(zhì)的大量滲漏，并導(dǎo)致平均通道熒光強(qiáng)度（MnX）的顯著提高。Garviecin LG34導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜上形成了較大的孔洞，細(xì)胞膜的滲透性增大，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

細(xì)菌素；Garviecin LG34；金黃色葡萄球菌；抗菌機(jī)理

0 引言

隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)及對(duì)食品安全的重視程度逐漸提高，開發(fā)新型安全高效的抗菌劑進(jìn)行食品防腐保藏已經(jīng)成為食品工業(yè)的重要發(fā)展方向。乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞外的具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)[1]。與化學(xué)防腐劑相比，乳酸菌細(xì)菌素在起到抑菌殺菌作用的同時(shí)，對(duì)人體沒有任何毒副作用，可以被人體的蛋白酶水解成氨基酸，因此被國(guó)內(nèi)外公認(rèn)為安全的生物防腐劑[2]。

課題組在前期的研究中，從發(fā)酵酸黃瓜中篩選到1株產(chǎn)新型廣譜乳酸菌細(xì)菌素的Lactococcus garvieae LG34（格氏乳球菌），并對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)菌素Garviecin LG34（格氏乳球菌素）進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)分子量和抑菌譜不同于目前已發(fā)現(xiàn)的格氏乳球菌素，是一種新型廣譜的細(xì)菌素，不僅能抑制革蘭氏陽性菌，也能抑制革蘭氏陰性菌，具有作為生物防腐劑的應(yīng)用前景[3-4]。為了更好地進(jìn)行Garviecin LG34在食品中的應(yīng)用研究，試驗(yàn)以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為指示菌，探討了Garviecin LG34對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌機(jī)理，為新型廣譜生物防腐劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 Garviecin LG34

將Lactococcus garvieae LG34斜面菌種1~2環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有10mLMRS液體培養(yǎng)基的試管中混合均勻，于28~30℃條件下培養(yǎng)18 h，按2%接種量接入裝有200mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃條件下發(fā)酵36 h。將發(fā)酵液離心（6 000 r/min，15 min），將上清液的pH值調(diào)整至7.0，用旋蒸儀濃縮10倍。用4倍冷乙醇沉淀處理，取上清液用旋蒸儀濃縮至原體積的1/2。

1.1.2 指示菌

金黃色葡萄球菌ATCC 63589，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞內(nèi)K+滲漏的影響

將金黃色葡萄球菌ATCC 63589過夜培養(yǎng)的菌懸液，加入Garviecin LG34，終濃度為320 AU/mL。于37℃條件下放置，隔20min取樣，菌液于0℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心7min。采用M5型原子吸收光譜儀測(cè)定上清液中的K+濃度。

1.2.2 Garviecin LG34對(duì)260 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

將處于對(duì)數(shù)期的10 mL OD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min收集菌體，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用320 AU/mL細(xì)菌素Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理0，20，40，60，80，100min后，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min收集菌體，上清液經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。于波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定細(xì)胞懸浮液的吸光度，以菌體懸浮在不含細(xì)菌素的純凈水中作為空白對(duì)照[5]。

1.2.3 Garviecin LG34對(duì)280 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

將處于對(duì)數(shù)期的10 m L OD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min收集菌體，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用320 AU/mL細(xì)菌素Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理0，20，40，60，80，100min后，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15 min收集菌體，上清液經(jīng)0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。于波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定細(xì)胞懸浮液的吸光度，以菌體懸浮在不含細(xì)菌素的純凈水中作為空白對(duì)照[5]。

1.2.4 Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸類物質(zhì)滲漏的影響

處于對(duì)數(shù)期的10mLOD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15min離心收集菌體，用10mL的5mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用抑菌Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理30 min和60 min后，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心15min收集菌體。以菌體懸浮在不含Garviecin LG34的純凈水中作為空白對(duì)照，以碘化丙啶（PI）為染色劑，用流式細(xì)胞儀分析試驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的PI熒光強(qiáng)度[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞內(nèi)K+滲漏的影響

細(xì)胞內(nèi)K+是否大量滲漏到細(xì)胞外，能反映其細(xì)胞通透性的提高，為了研究Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞通透性的影響，試驗(yàn)研究了細(xì)菌素作用金黃色葡萄球菌后細(xì)胞內(nèi)K+滲漏的情況。

對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)K+泄露的影響見圖1。

圖1 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)K+泄露的影響

由圖1可知，細(xì)菌素Garviecin LG34作用金黃色葡萄球菌20min以后，細(xì)胞內(nèi)的K+大量滲漏到細(xì)胞外，與空白對(duì)照相比差異顯著；作用80 min后，滲漏減慢。

2.2 Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞內(nèi)260 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

核酸類物質(zhì)的最大吸收峰為260 nm，核酸物質(zhì)的滲漏情況能反映出細(xì)胞膜上大孔洞的形成情況，因此試驗(yàn)研究了Garviecin LG34對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)260 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響。

對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)260 nm紫外吸收物質(zhì)泄露的影響見圖2。

圖2 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)260 nm紫外吸收物質(zhì)泄露的影響

核酸最大吸收波長(zhǎng)為260 nm，于波長(zhǎng)260 nm處的光密度通常被用來評(píng)價(jià)核酸的濃度。由圖2可知，用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌40 min后，于波長(zhǎng)260 nm處的ΔOD顯著高于用蒸餾水處理的空白樣品。結(jié)果表明，用Garviecin LG34處理后，細(xì)胞內(nèi)260 nm紫外吸收物質(zhì)可以大量滲透到細(xì)胞外。

2.3 Garviecin LG34對(duì)細(xì)胞內(nèi)280 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，因此在280 nm的光密度通常被用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的濃度，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的滲漏情況能反映出細(xì)胞膜上大孔洞的形成情況，因此試驗(yàn)研究了Garviecin LG34對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)280 nm紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響。

對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)280 nm紫外吸收物質(zhì)泄露的影響見圖3。

圖3 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)280 nm紫外吸收物質(zhì)泄露的影響

由圖3可知，用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌40min后，于波長(zhǎng)280 nm處的ΔOD顯著高于用蒸餾水處理的空白樣品。這些結(jié)果表明用Garviecin LG34處理后，細(xì)胞內(nèi)280 nm紫外吸收物質(zhì)可以大量滲透到細(xì)胞外。

2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的通透性

流式細(xì)胞儀目前被廣泛用于細(xì)胞損傷的研究中，主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)為平均通道熒光強(qiáng)度（MnX）。試驗(yàn)研究了用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌對(duì)細(xì)胞通透性的影響。

用Garviecin LG34處理后金黃色葡萄球菌的平均通道熒光強(qiáng)度見表1。

表1 用Garviecin LG34處理后金黃色葡萄球菌的平均通道熒光強(qiáng)度

由表1可知，用Garviecin LG34處理30 min和60min后，MnX從2.66分別提高到5.23和6.43。這說明Garviecin LG34的處理導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌細(xì)胞中碘化丙錠摻入量的增加，說明細(xì)胞膜的滲透性增大，在細(xì)胞膜上形成了較大的孔洞。

3 結(jié)論

細(xì)菌素Garviecin LG34作用金黃色葡萄球菌20min以后，細(xì)胞內(nèi)的K+大量滲漏到細(xì)胞外，與空白對(duì)照相比差異顯著；在作用80 min后，滲漏減慢。用Garviecin LG34處理后，細(xì)胞內(nèi)260 nm和280 nm紫外吸收物質(zhì)可以大量滲透到細(xì)胞外。用Garviecin LG34處理30 min和60 min后，MnX從2.66分別提高到5.23和6.43。這說明Garviecin LG34的處理導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌細(xì)胞中碘化丙錠摻入量的增加，說明細(xì)胞膜的滲透性增大，在細(xì)胞膜上形成了較大的孔洞。

[1]劉國(guó)榮，李平蘭，王成濤.乳酸菌細(xì)菌素作為天然生物防腐劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012（2）：64-69.

[2]丹彤，張和平.乳酸菌細(xì)菌素的分類、生物合成及其應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2013，41（3）：29-32.

[3]Yurong Gao，Dapeng Li，Shan Liu，etal.Garviecin LG34，a novel bacteriocin produced by Lactococcus garvieae isolated from traditional Chinese fermented cucumber[J].Food Control，2015（5）：896-899.

[4]劉姍，高玉榮.格氏乳球菌素LG34生物穩(wěn)定性的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25（3）：67-70.

[5]翟培，韓晉輝，侯麗霞，等.家蠅抗菌肽的抑菌動(dòng)力學(xué)研究及其機(jī)理初探[J].中國(guó)生物工程雜志，2006，26（11）：33-39.

[6]喬長(zhǎng)庚.溫和壓力對(duì)酵母活性與犁頭霉生物轉(zhuǎn)化的影響[D].天津：天津科技大學(xué)，2005.◇

AntimicrobialMechanism of Garviecin LG34

GAO Yurong，CUISuping，XUGuodong，LIDapeng，ZHANG Liyuan，WANG Xin
（Food College，Heilongjiang BayiAgricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Using Staphylococcusaureus as indicator strain，the antimicrobialmechanism of Garviecin LG34 againstGram-positive bacteria is researched.The results show that Garviecin LG34 led to the great leakage of K+，and cell substance absorbing ultraviolet in 260 nm and 280 nm，and the significant increase in MnX.Garviecin LG34 results in the produce of large hole in the cellmembrane of Staphylococcus aureus and the leakage increase and finially led the cell dead.

bacteriocin；Garviecin LG34；Staphylococcus aureus；antimicrobialmechanism

Q93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.005

1671-9646（2017）04a-0014-03

2017-03-19

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（面上）項(xiàng)目（12541589）。

高玉榮（1970—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛鞍l(fā)酵工程方面的教學(xué)及研究。