劉珍洪，高 琳，汪文來(lái)，趙紅霞，高 蔚，安致君，郭 蓉，吳丹桐，Michael Xi Zhu，楊 楨△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.美國(guó)德克薩斯大學(xué)休斯頓健康科學(xué)中心，休斯頓，美國(guó) 77030)

【方藥研究】

羌活提取物對(duì)熱敏通道TRPV1的影響?

劉珍洪1，高 琳1，汪文來(lái)2，趙紅霞2，高 蔚1，安致君1，郭 蓉1，吳丹桐1，Michael Xi Zhu3△，楊 楨1△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.美國(guó)德克薩斯大學(xué)休斯頓健康科學(xué)中心，休斯頓，美國(guó) 77030)

目的：探討羌活水提物和醇提物對(duì)熱敏通道TRPV1的影響。方法：在瞬轉(zhuǎn)人源TRPV1的HEK293細(xì)胞上，運(yùn)用膜片鉗技術(shù)測(cè)量羌活提取物對(duì)細(xì)胞跨膜電流的影響。結(jié)果：羌活提取物可激活TRPV1通道產(chǎn)生明顯的跨膜電流，該跨膜電流與TRPV1激動(dòng)劑辣椒素誘發(fā)的電流在電流密度和電流-電壓關(guān)系各方面均類(lèi)似；羌活水提物在生藥1 g/ml時(shí)稀釋10倍左右，對(duì)跨膜電流的影響達(dá)到最大，并可以被TRPV1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑辣椒素完全阻斷。結(jié)論：羌活提取物中含TRPV1激動(dòng)劑，該通道活化后產(chǎn)生的系列效應(yīng)可能是羌活解表、止痛的重要分子機(jī)制。

羌活; 熱敏通道 TRPV1; 激動(dòng)劑;解表;止痛

羌活是常用解表中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中羌活與獨(dú)活不分，言其有“止痛”作用。唐·《新修本草》將羌活、獨(dú)活分列。唐·《藥性論》言羌活“味苦，辛”。羌活有濃郁的芳香氣味，《中藥學(xué)》將其功效概括為解表散寒、祛風(fēng)濕、止痛，其藥性符合香草酸受體(TRPV1)激動(dòng)劑的特征。TRPV1為具有鈣離子通透性的非選擇性陽(yáng)離子通道，主要分布在屬于傷害性感受器類(lèi)型的感受神經(jīng)元及其神經(jīng)末梢的細(xì)胞膜上。作為熱敏通道[1]，TRPV1在正常情況下主要為大于43°C的高溫所激活導(dǎo)致熱痛，同時(shí)也參與體溫調(diào)節(jié)。病理狀態(tài)下，組織酸化、身體發(fā)熱、多種炎癥因子的產(chǎn)生也能引起TRPV1通道的活化[2]，造成炎癥痛。作為介導(dǎo)外周疼痛的主要通道之一，TRPV1的激動(dòng)劑常常是痛覺(jué)敏化劑，但也因敏化引起的脫敏而可以作為鎮(zhèn)痛劑?，F(xiàn)已證明，眾多辛味中藥和食品可以激活TRPV1通道，其中辣椒素(Capsaicin)是研究TRPV1最常用的激動(dòng)劑。因此，TRPV1被稱(chēng)為辣椒素受體。中醫(yī)臨床以及動(dòng)物行為學(xué)已經(jīng)證明，羌活有很好的止痛作用[4-5]，然而其分子機(jī)制并不清楚，我們推測(cè)羌活可能通過(guò)TRPV1通道發(fā)揮藥效。本研究使用羌活的水提物和醇提物，在轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細(xì)胞上，使用膜片鉗技術(shù)，對(duì)細(xì)胞跨膜電流進(jìn)行了測(cè)試，以確定羌活對(duì)TRPV1通道的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

中藥羌活(2016年3月購(gòu)自北京同仁堂藥店)、TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)、質(zhì)粒GFP(北京愛(ài)思益普生物科技股份有限公司)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、Capsazepine、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calcium chloride(Sigma)。

1.2 儀器

EPC-10 Quattro膜片鉗放大器(Heka，德國(guó))、PatchMaster數(shù)據(jù)獲取軟件(Heka，德國(guó))、P-97拉制儀器(Sutter Instruments，美國(guó))、IGOR-Pro分析軟件(WaveMetrics Inc，美國(guó))、300克密封型搖擺式粉碎XL-06B(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海虹昕電子儀器儀表有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(常州潤(rùn)華電器有限公司)、SHZ-III型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羌活提取物制備 75%乙醇提取物的制備：稱(chēng)取80 g羌活用粉碎機(jī)粉碎成粉末，加入8倍量的75%乙醇與之混合，浸泡30 min，95℃恒溫水浴鍋上回流提取器回流提取2 h，冷卻至室溫后雙層濾紙過(guò)濾，收集濾液，剩余的藥渣用于再次提取。重復(fù)提取1次，合并2次提取的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收乙醇，所得的膏狀物(不含乙醇)用雙蒸水調(diào)濃度至2 g/ml分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞外液稀釋100倍(即20 mg/ml)。水提物的制備：稱(chēng)取50 g羌活加8倍量雙蒸水浸泡30 min，大火加熱至沸騰，文火保持微沸30 min，待冷卻后傾出藥汁，剩余的藥渣加5倍量雙蒸水再次煎煮，合并2次藥汁雙層濾紙過(guò)濾，99℃恒溫水浴鍋加熱濃縮調(diào)濃度為1 g/ml，3500 r/min離心15 min后取上清液即得羌活水提物，分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用細(xì)胞外液按照1∶5、1∶10、1∶20的濃度進(jìn)行稀釋。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染(HEK293/TRPV1) 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為人胚腎293細(xì)胞(Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK293)。質(zhì)粒是根據(jù)GenBank所載基因信息構(gòu)建：Homo sapiens transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1 (TRPV1)，transcript variant 1，GenBank 的保藏號(hào)NM_080704.2。細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞植于直徑12 mm細(xì)胞爬片中并置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前換為不含抗生素的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，質(zhì)粒與稀釋液DMEM在室溫下平衡15 min至20℃左右，使用無(wú)血清的DMEM將轉(zhuǎn)染試劑稀釋至終濃度為5 μL轉(zhuǎn)染試劑/100 μL DMEM，使用無(wú)菌管稀釋輕柔混勻。將2 μg TRPV1質(zhì)粒和600ng GFP質(zhì)粒共同加入100 μL轉(zhuǎn)染試劑稀釋液中，輕柔混勻后將轉(zhuǎn)染試劑、DNA復(fù)合物于15～20℃下靜置15 min。從培養(yǎng)箱中取出預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)皿，將轉(zhuǎn)染試劑、DNA復(fù)合物逐滴加入，轉(zhuǎn)染后4 h換成完全培養(yǎng)基(無(wú)雙抗)，孵育細(xì)胞24～72 h內(nèi)進(jìn)行電生理檢測(cè)。

1.3.3 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在室溫20～25℃下進(jìn)行，將細(xì)胞爬片放置于專(zhuān)門(mén)的記錄小室中，固定浴液電極。顯微鏡下選取外形完整、形狀規(guī)則、邊緣整齊、表面光滑無(wú)顆粒、橫紋清晰、無(wú)收縮的長(zhǎng)桿狀細(xì)胞。膜片鉗放大器系統(tǒng)通過(guò)A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器與計(jì)算機(jī)進(jìn)行連接，PatchMaster軟件控制相關(guān)的刺激信號(hào)以及電流、電壓信號(hào)的采集。玻璃微電極拉制儀拉制玻璃毛胚成尖端直徑1～1.5 μm的玻璃微電極，灌入電極內(nèi)液后安裝于電極夾持器上與探頭和放大器聯(lián)通。顯微鏡觀察下用三維操縱儀調(diào)節(jié)電極尖端的位置使其移向細(xì)胞表面，輕壓細(xì)胞微變形，1 ml注射器負(fù)壓吸引封接細(xì)胞，形成高阻封接(Giga seal)至1 GΩ以上，完成封接后進(jìn)行電極電容補(bǔ)償。觀察1～2 min，如果不能自行破膜則用1 ml注射器負(fù)壓吸引破膜，形成全細(xì)胞的記錄模式。對(duì)全細(xì)胞膜電容進(jìn)行補(bǔ)償后給予相應(yīng)的測(cè)試程序進(jìn)行信號(hào)采集。采樣頻率為10 kHz。

電極內(nèi)液成分為CsCl 140 mmol/L， CaCl25 mmol/L， ATP-Mg 1 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， EGTA 10 mmol/L， MgCl22 mmol/L，用CsOH 調(diào)至pH值 7.2。自由Ca2+濃度維持在85 nmol/L。電極外液成分為NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L， MgCl22 mmol/L， CaCl22 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， glucose 5 mmol/L，用NaOH 調(diào)至pH 7.4。細(xì)胞維持電壓(holding potential,Vhold)設(shè)定為-80 mV，在Vhold的基礎(chǔ)上間隔1 s給予細(xì)胞一個(gè)從-100 mV到+100 mV連續(xù)電壓斜坡(voltage ramp)刺激(圖1-B)或-80 mV電壓下連續(xù)記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 羌活醇提物對(duì)TRPV1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的影響

圖1顯示，在對(duì)羌活75%乙醇提取物的研究中，將羌活醇提物用正常TRPV1細(xì)胞外液按1∶100稀釋?zhuān)瑴y(cè)試羌活醇提物(20 mg/ml)對(duì)表達(dá)TRPV1細(xì)胞跨膜電流的影響，細(xì)胞外液為陰性對(duì)照，1 μmol/L辣椒素(capsaicin)引起的電流作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)先加細(xì)胞外液觀察電流的基線水平，穩(wěn)定后滴加測(cè)試樣品，當(dāng)電流達(dá)到峰值下降后用細(xì)胞外液進(jìn)行洗脫(wash)，使電流恢復(fù)至給藥前狀態(tài)(基線水平)，最后滴加陽(yáng)性藥1 μmol/L辣椒素對(duì)比其誘導(dǎo)的跨膜電流(圖1-A)。細(xì)胞電容(pF)代表細(xì)胞的大小，每個(gè)細(xì)胞的大小不一，故數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用+100 mV電壓下電流密度(=跨膜電流/細(xì)胞電容)(pA/ pF)。電流增大倍數(shù)=測(cè)試樣品跨膜電流/細(xì)胞外液基底跨膜電流。對(duì)辣椒素活性百分比(%)=測(cè)試樣品跨膜電流/辣椒素跨膜電流100%。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞外液比較，羌活醇提物能誘導(dǎo)表達(dá)TRPV1細(xì)胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流(圖1-C，羌活醇提物，206±47 pA/pF，n=10，細(xì)胞外液，57.6±7.2pA/pF;n=10；P<0.01)。羌活醇提物誘導(dǎo)的電流增大倍數(shù)為(3.4±0.6,圖1-D，n=10，P<0.01)，是1 μmol/L辣椒素誘導(dǎo)的電流增大倍數(shù)(7.9±1.2，n=10，P<0.001)的一半左右。在與1 μmol/L辣椒素誘導(dǎo)的跨膜電流比較中發(fā)現(xiàn)，羌活醇提物誘導(dǎo)的電流與細(xì)胞外液中檢測(cè)到的基底跨膜電流存在明顯差異(圖1-E，羌活醇提物60±14，細(xì)胞外液(20±7%，P<0.01)。綜上，羌活醇提物具有激活熱敏通道TRPV1產(chǎn)生跨膜電流的效應(yīng)。

圖1 羌活醇提物與辣椒素對(duì)轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細(xì)胞全細(xì)胞電流影響注：A.+100 mV(空心點(diǎn))和-100 mV(實(shí)心點(diǎn))電壓下跨膜電流時(shí)程圖。a、b、c顯示圖B中電流-電壓(I-V)曲線代表的時(shí)間點(diǎn)；B.在細(xì)胞外液(a)、羌活醇提物峰值b、辣椒素峰值c點(diǎn)用電壓斜坡(voltage ramp)檢測(cè)到的I-V關(guān)系曲線；C-E.各組+100 mV電壓下電流密度(C)、電流增大倍數(shù)(D)和E對(duì)辣椒素活性百分比(E)統(tǒng)計(jì)圖(Mean±SEM)；組間比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 羌活水提物濃度效價(jià)以及辣椒平對(duì)其抑制作用

圖2、3顯示，在對(duì)羌活水提物的研究中，將羌活水提物與細(xì)胞外液按1∶5、1∶10和1∶20的比例稀釋?zhuān)瑴y(cè)試這3個(gè)濃度羌活水提物對(duì)表達(dá)TRPV1的HEK293細(xì)胞跨膜電流的影響。結(jié)果顯示，1∶10稀釋即可產(chǎn)生最大的跨膜電流。在稀釋到1∶20的時(shí)候，跨膜電流已經(jīng)非常小。為進(jìn)一步證明水提物對(duì)TRPV1的作用，使用TRPV1的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑辣椒平(10 μmol/L)與羌活水提物同用，證明可完全抑制同一稀釋濃度羌活水提物(1∶10)誘導(dǎo)的跨膜電流。

圖2 羌活水提物3個(gè)不同稀釋濃度在同一細(xì)胞與辣椒素(30 M)誘導(dǎo)的跨膜電流比較注：圖示-80 mV電壓下連續(xù)記錄的跨膜電流時(shí)程。

圖3 TRPV1通道競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑辣椒平(capsazepine)完全阻斷了羌活水提物(1∶10稀釋)誘導(dǎo)的跨膜電流注：-80 mV電壓下連續(xù)記錄

3 討論

羌活是辛溫解表藥且“氣味雄烈”，功效為祛風(fēng)勝濕止痛。行為學(xué)研究證實(shí)，羌活有很好的止痛作用[6-9]。本研究使用羌活水提、醇提物嘗試了解羌活的可能分子靶點(diǎn)。膜片鉗數(shù)據(jù)顯示，羌活混合物具有明確的TRPV1激動(dòng)劑效應(yīng)，該效應(yīng)能夠被TRPV1的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑阻斷，因此羌活中含有明確的TRPV1受體激動(dòng)劑成分。

前期的研究中我們已經(jīng)討論了TRPV1通道對(duì)惡寒發(fā)熱的影響機(jī)制[10]。惡寒發(fā)熱涉及到體溫變化。人體溫度調(diào)節(jié)由一個(gè)多傳感器、多效應(yīng)器的系統(tǒng)完成[11-12]。體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮整體功效由相互獨(dú)立的多個(gè)效應(yīng)器環(huán)相互協(xié)調(diào)完成，每一個(gè)熱效應(yīng)器環(huán)都是由1個(gè)惟一的傳入神經(jīng)通路和受其支配的感受器構(gòu)成[13]，而TRPV1在啟動(dòng)這類(lèi)熱效應(yīng)器時(shí)發(fā)揮主導(dǎo)作用[12-14]。辛味中藥產(chǎn)生的溫?zé)岣锌梢灾苯拥挚弓h(huán)境或感染誘發(fā)的寒戰(zhàn)，現(xiàn)以證明不少辛味中藥對(duì)TRPV1有激動(dòng)效應(yīng)。在疼痛感知方面，瞬時(shí)受體電位(TRP)離子通道家族的3個(gè)成員即TRPV1、TRPM8和TRPA1 是寒熱和化學(xué)刺激激活感覺(jué)神經(jīng)元產(chǎn)生急性或持續(xù)性疼痛的分子探測(cè)器，這些受體的激動(dòng)劑或抑制劑在止痛方面發(fā)揮著重要作用[15]。

在濃度與藥效的關(guān)系方面，本研究使用水提物的3個(gè)不同濃度對(duì)跨膜電流的影響顯示，在室溫下峰值電流在1∶10左右最大，當(dāng)濃度稀釋達(dá)到1∶20的時(shí)候，跨膜電流幾乎消失。但有鑒于TRPV1為熱敏感通道，其對(duì)激動(dòng)劑的敏感度會(huì)隨著溫度提高而增加許多，因此在正常體溫下激活TRPV1通道對(duì)于羌活的濃度要求應(yīng)該會(huì)低很多。

基于目前對(duì)TRPV1的研究，我們已經(jīng)可以很好地理解《中藥學(xué)》中的羌活以及《方劑學(xué)》中含羌活方劑的功用。以目前《方劑學(xué)》教材為例，在敗毒散、九味羌活湯、羌活勝濕湯和川芎茶調(diào)散等4個(gè)使用羌活的方劑中，作為湯劑使用，羌活的推薦用量是6～10 g。以水煎劑400 ml每天計(jì)算，羌活的生藥濃度在1∶40～1∶67之間。以此推斷，羌活在方劑中極有可能單獨(dú)發(fā)揮作用，但也不排除需賴(lài)于其他藥物的協(xié)同作用。這種協(xié)同性在相須配伍的方式中可能體現(xiàn)在辛味相近的中藥中含有一樣的化學(xué)成分，多藥同用的時(shí)候形成量的疊加，進(jìn)而發(fā)揮應(yīng)有作用。相須配伍的另外一個(gè)方式，可能就是多種化學(xué)成分作用于同一靶點(diǎn)。以TRPV1通道的激動(dòng)劑為例，前者如川芎、藁本都含川芎內(nèi)酯，后者如吳茱萸和生姜所含的不同成分都是TRPV1受體激動(dòng)劑。

敗毒散是重要的解表劑，主治氣虛外感證，可見(jiàn)“憎寒壯熱”，羌活、獨(dú)活是其君藥。惡寒發(fā)熱是表證的特征性癥狀，除敗毒散外，九味羌活湯也是治療外感風(fēng)寒濕而致身疼痛的重要方劑?！斗絼W(xué)》中另外還有川芎茶調(diào)散、大秦艽湯、羌活勝濕湯含有羌活，它們都發(fā)揮祛風(fēng)濕止痛的作用?，F(xiàn)具有批準(zhǔn)文號(hào)的中成藥中，含羌活的處方有441個(gè)之多，基本上屬于解表、退熱、祛風(fēng)濕、止痛類(lèi)[16]。TRPV1在感染性疾病惡寒、發(fā)熱的途徑中發(fā)揮著重要作用[10]，羌活活化TRPV1可能是敗毒散等方藥解表作用實(shí)現(xiàn)的重要途徑之一。

在本研究中，我們首先報(bào)道羌活的水提物和醇提物都能激活TRPV1，在細(xì)胞和分子層面上對(duì)羌活的藥效有了進(jìn)一步的了解。羌活含有眾多的化學(xué)成分[17]，2010版《中國(guó)藥典》將羌活中的羌活醇和異歐前胡素含量作為羌活飲片的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。在這些化學(xué)成分中，尚無(wú)文獻(xiàn)記載單體活性成分可以活化TRPV1通道。在類(lèi)似的結(jié)構(gòu)中，與羌活功效類(lèi)似的白芷，其含有主要藥性成分歐前胡素(Furanocoumarin imperatorin)，能夠活化TRPV1通道。進(jìn)一步膜片鉗證據(jù)顯示，羌活中存在未經(jīng)報(bào)告的激動(dòng)劑(數(shù)據(jù)待發(fā))。

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Effects of Notopterygium Incisum Extracts on the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 of Thermosensitire Channel

LIU Zhen-hong1, GAO Lin1, WANG Wen-lai2, ZHAO Hong-xia2, GAO Wei1, AN Zhi-jun1, GUO rong1, WU Dan-tong1, Michael Xi Zhu3Δ, YANG Zhen1Δ
(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.InstituteofBasicTheory,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3.DepartmentofIntegrativeBiologyandPharmacology,UniversityofTexasHealthScienceCenteratHouston,Houston,TX77030,USA)

Objective: To investigate the effect of ethanol extracts and water extracts ofNotopterygiumincisum on thermosensitive channel, Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1). Methods: Whole cell voltage clamp technique was used to record transmembrane currents induced by theNotopterygiumextracts in HEK 293 cells that expressed human TRPV1. Results: Both ethanol and water extracts ofNotopterygiumincisum evoked robust currents comparable to that by the known TRPV1 agonist, capsaicin, in current density and current-voltage relationship. The maximum effect ofNotopterygiumwater extracts was reached at 100 mg/ml. TheNotopterygium-inducedTRPV1 current was completely abolished by the specific TRPV1 antagonist, capsazepine (10 μM). Conclusions: One or more components ofNotopterygiumextracts are TRPV1 agonists, which may underlie the analgesic and relieving exterior syndrome effects ofNotopterygium. Key words:Notopterygiumincisum; Thermosensitive channel; TRPV1; Relieving exterior syndrome; analgesic

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573847)-基于熱敏通道的交叉脫敏探討理中丸、小建中湯和吳茱萸溫中散寒功效的共同作用機(jī)制；北京中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項(xiàng)目(JJ2015-56)-基于寒痛通道TRPA1的吳茱萸桂枝對(duì)宮寒小鼠的子宮容受性影響研究；北京市“3+3”李慶業(yè)名老中醫(yī)工作站(2009-JC-31)；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題項(xiàng)目(YZ-1316)-補(bǔ)腎化痰散瘀法治療多囊卵巢綜合證的機(jī)理探討

R284.2

B

1006-3250(2017)04-0553-05

2016-10-14

△通訊作者：Michael Xi Zhu，男，教授，從事細(xì)胞信號(hào)與離子通道的研究，E-mail:Michael.x.zhu@uth.tmc.edu;楊 楨，男，教授，從事中醫(yī)處方法、辛味中藥的藥效研究,Tel：010-64286992,E-mail：for3000yz@aliyun.com。