聶建芳

[摘要]目的 探討免疫制劑鹽酸左旋咪唑配合外用貝復(fù)濟(jì)治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的臨床效果。方法 選取2014年1月～2015年12月我院接診的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者130例，按就診前后隨機(jī)分成觀(guān)察組和對(duì)照組，各65例，觀(guān)察組采用鹽酸左旋咪唑片配合貝復(fù)濟(jì)無(wú)菌噴霧劑外用，對(duì)照組單純采用鹽酸左旋咪唑。通過(guò)治療前后血清T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞；血清輔助性T淋巴細(xì)胞（helper T cell，Th），Th1（IFN-γ、TNF-α、IL-2）和Th2（IL-4、IL-6、IL-10）類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平及臨床療效的比較，分析鹽酸左旋咪唑片配合貝復(fù)濟(jì)外用的臨床效果。結(jié)果 觀(guān)察組T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+治療前后檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），對(duì)照組治療前后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀(guān)察組輔助T淋巴細(xì)胞、Th1（IFN-γ、TNF-α、IL-2）、Th2（IL-4、IL-6、IL-10）、IFN-γ/IL-4治療前后檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），對(duì)照組治療前后IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其他指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后INF-α、IL-6、比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀(guān)察組臨床總有效率為92.08%，復(fù)發(fā)率為9.23%，對(duì)照組有效率為73.85%，復(fù)發(fā)率為36.92%，兩組總療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 鹽酸左旋咪唑片配合貝復(fù)濟(jì)外用能有效改善復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者T淋巴細(xì)胞亞群及血清輔助性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，提高復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的治療效果，降低復(fù)發(fā)率。

[關(guān)鍵詞]復(fù)發(fā)性口腔潰瘍；左旋咪唑；貝復(fù)濟(jì)；T淋巴細(xì)胞亞群；輔助T淋巴細(xì)胞；臨床療效

[中圖分類(lèi)號(hào)] R781.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（c）-0091-04

Efficacy analysis of immunosuppressive agents with topical Recombinant bovine basic fibroblast growth factor on recurrent oral ulcers

NIE Jian-fang

Department of Stomatology，the Third Hospital of Nanchang City in Jiangxi Province，Nanchang 330009，China

[Abstract]Objective To analyze clinical efficacy of recurrent oral ulcers treated by immune agents Levamisole hydrochloride with topical rb-bFGF （recombinant bovine basic fibroblast growth factor）.Methods 130 patients with recurrent oral ulcers from January 2014 to December 2015 in our hospital were randomly divided into observation group and control group according to treatment around，65 cases in each group.The patients in observation group were treated by Levamisole hydrochloride tablets with rb-bFGF sterile topical sprays，patients in control group were treated by Lvamisole hydrochloride.CD3+，CD4+，CD8+ cells in T lymphocytes；helper T lymphocytes （helper T cell Th），Th1（IFN-γ，TNF-α，IL-2），Th2（IL-4，IL-6，IL-10） in the serum and the clinical efficacy were compared before and after treatment，the clinical effects of Levamisole hydrochloride tablets with rb-bFGF topical was analyzed for patients with recurrent oral ulcers.Results CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ of T lymphocytes in patients of observation group were significant differenres before and after treatment（P<0.01），no significant difference in the control group after treatment（P>0.05）.After treatment，CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ were significant differences between two groups（P<0.05）.The helper T lymphocytes，Th1（IFN-γ，TNF-α，IL-2），Th2（IL-4，IL-6，IL-10），IFN-γ/IL-4 in observation group were significant differences before and after treament（P<0.01），in addition to IL-6 was significant differece in the control group（P<0.01），others were no significant differences（P>0.05）.After treatment，INF-α，IL-6，were no significant differences，others were significant differenles（P<0.05）. Clinical total effective rate was 92.08%，the recurrence rate of 9.23% in observation group，the control group was 73.85%，the recurrence rate of 36.92%，there was significant difference between two groups（P<0.01）.Conclusion Treatment by Levamisole hydrochloride tablets with b-bFGF topical can effectively improve T lymphocyte subsets and serum helper T lymphocytes expressing for the patients with recurrent oral ulcers and reduce their the recurrence rate.

[Key words]Recurrent oral ulcers；Levamisole；Recombinant bovine basic fibroblast growth factor（rb-bFGF）；T lymphocyte subsets；Helper T lymphocytes；Clinical efficacy

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍又稱(chēng)復(fù)發(fā)性阿弗他性口炎，是口腔黏膜中最常見(jiàn)的疾病?？谇粷兊牡湫吞卣鳛闇\表性、疼痛性、復(fù)發(fā)性[1]，常好發(fā)于唇、頰、舌側(cè)黏膜?；疾∫蛩赜羞z傳、過(guò)敏、藥物、激素、焦慮、免疫異常等，其中20%源于患者T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起[2]。本病一年四季均能發(fā)生，10 d左右可以自愈，據(jù)統(tǒng)計(jì)患病率達(dá)20%，在特定人群中可高達(dá)60%，兒童發(fā)病率約15%，成年人發(fā)病率約85%[3]。

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病機(jī)制尚未明確，由于反復(fù)發(fā)作，潰瘍疼痛引起患者飲食困難，對(duì)患者的日常生活、營(yíng)養(yǎng)狀況、工作、學(xué)習(xí)造成不良的影響，同時(shí)外界反復(fù)刺激所致的口腔潰瘍存在癌變的風(fēng)險(xiǎn)。雖然臨床上治療該病的方法很多，但目前還無(wú)比較理想的方法[4]。本研究根據(jù)該病發(fā)病原理，采用免疫制劑左旋咪唑配合貝復(fù)濟(jì)（rb-bFGF）外用，觀(guān)察其臨床療效，探索一種復(fù)發(fā)性口腔潰瘍比較好的治療方法。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月～2015年12月來(lái)我院就診的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者130例，按就診前后隨機(jī)分成觀(guān)察組與對(duì)照組，各65例，觀(guān)察組中男23例，女42例；年齡（24.71±8.14）歲；病程（5.51±3.32）年。對(duì)照組中男25例，女40例；年齡（25.12±7.54）歲，病程（6.07±3.16）年，兩組性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具有可比性。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

①口腔表面出現(xiàn)滲出以及灼痛的感覺(jué)，大小不等的圓形、橢圓形潰瘍；②間歇性地發(fā)作；③單發(fā)或多發(fā)性，經(jīng)常發(fā)生在唇、臉頰以及舌頭等處，數(shù)目 1～5個(gè)，直徑≥5 mm；④局部疼痛，潰瘍充血，邊緣整齊，基部不硬，中心稍凹，其上覆以灰黃色或淺黃白色纖維素性假膜；⑤多數(shù)患者無(wú)全身的表現(xiàn)，但是潰瘍直徑一般在10～30 mm深及黏膜下層甚至肌層，治好后會(huì)留下瘢痕；⑥所有患者均為口腔潰瘍反復(fù)發(fā)作>1年，發(fā)病間隔時(shí)間<1個(gè)月，其中輕型發(fā)作≤72 h，重型抽血時(shí)口內(nèi)至少存在1個(gè)月以上潰瘍；⑦簽署知情同意書(shū)；⑧經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

①白血病、貧血、消化性潰瘍、克隆病、急性感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤患等；②妊娠期婦女；③24 h內(nèi)使用鎮(zhèn)痛藥，1個(gè)月內(nèi)使用抗生素，3個(gè)月內(nèi)使用免疫制劑；④3個(gè)月內(nèi)吸煙者、嗜酒者。

1.4方法

觀(guān)察組采用鹽酸左旋咪唑片（武漢新贏和醫(yī)藥化工有限公司，片劑25 mg/片），3次/d， 50 mg/次，連服2 d后停5 d，連續(xù)2周。rb-bFGF無(wú)菌噴霧劑（含bFGF 36 000 AU），4次/d，1～2噴/次。對(duì)照組只采用鹽酸左旋咪唑片，用法同上。連續(xù)2周進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.5觀(guān)察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法

比較血清T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、 CD4+、CD8+細(xì)胞；血清輔助性T淋巴細(xì)胞（helper T cell Th） Th1 （IFN-γ、TNF-α、IL-2）和Th2 （IL-4、IL-6、IL-10）類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。 清晨9點(diǎn)以前空腹抽外周靜脈血5 ml，1500 r/min離心15 min后提取上清液，迅速置于-80℃低溫冰箱保存。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞和IFN-γ，TNF-α，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10。試劑盒購(gòu)自Beckman Coulter， Inc. 中國(guó)有限公司，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)患者潰瘍面的恢復(fù)情況，具體如下。①顯效：潰瘍面消退>60%，口腔潰瘍基本愈合。②有效：潰瘍面消退30%～60%，口腔潰瘍雖然時(shí)有復(fù)發(fā)，但數(shù)量減少，程度減輕。③無(wú)效：口腔潰瘍癥狀及潰瘍無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，潰瘍面無(wú)消退或加重。總有效率=（顯效+有效）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的比較

觀(guān)察組T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 治療前后的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），對(duì)照組治療前后比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后CD3+、 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2兩組患者治療后前輔助T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的比較

觀(guān)察組輔助T淋巴細(xì)胞Th1 （IFN-γ、TNF-α、IL-2）、Th2 （IL-4、IL-6、IL-10）、IFN-γ/IL-4治療前后檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），對(duì)照組治療前后IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其他差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組治療后INF-α、IL-6比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3兩組患者治療后臨床效果的比較

兩組臨床療效觀(guān)察結(jié)果顯示，觀(guān)察組總有效率為92.08%，復(fù)發(fā)率為9.23%，對(duì)照組有效率為73.85%，復(fù)發(fā)率為36.92%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

3結(jié)果

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍?cè)谝话闳巳褐械陌l(fā)病率≤10%，在特定人群中，其發(fā)病率達(dá)50%～60%[5]。目前復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因尚不甚清楚，因此治療原則是防止繼發(fā)感染，減輕疼痛與促進(jìn)愈合、縮短療程[6]。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因不明，大多學(xué)者認(rèn)為復(fù)發(fā)性口腔潰瘍病因與免疫功能紊亂有關(guān)，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被認(rèn)為與該病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[7]。近來(lái)一些研究表明[8-12]，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是一種自身免疫性疾病，其病理過(guò)程與機(jī)體本身免疫，Th1/Th2失衡、CD4-、CD25-Foxp3-Trey減少、細(xì)胞因子分泌紊亂、膜抗體形成、變態(tài)反應(yīng)等一系列免疫紊亂反應(yīng)有關(guān)。1969年，Lehner等首次發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍前驅(qū)期病損部位有大量T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍前期以T輔助細(xì)胞占多數(shù)，潰瘍期轉(zhuǎn)為以細(xì)胞毒T細(xì)胞為主，愈合期又以T輔助細(xì)胞為主。

本研究結(jié)果表明，采用鹽酸左旋咪唑片配合外用rb-bFGF無(wú)菌噴霧劑治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的觀(guān)察組，治療前后T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，輔助性T淋巴細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ/IL-4均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單純鹽酸左旋咪唑片治療的對(duì)照組，除IL-6治療前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究進(jìn)一步證明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)與T淋巴細(xì)胞群及輔助T淋巴細(xì)胞有關(guān)。T淋巴細(xì)胞亞群的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者CD3+、CDQ+、CDa+以及CDQ+/CDa+亞群均有不同程度的變化，這些變化可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生的誘因[13-14]。輔助T淋巴細(xì)胞分為T(mén)h1與Th2，Th1細(xì)胞主要產(chǎn)IFN-γ、TNF-α、IL-2，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，Th1與Th2觀(guān)察組均有較大的變化，對(duì)照組雖然Th1與Th2的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但治療前后還是有一定變化，且兩組Th1與Th2與正常人有明顯的差異，與Al-Samadi等[15]發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者潰瘍形成主要取決于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的激活，以及Th1/Th2免疫失衡的結(jié)果一致。

本研究臨床療效觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，觀(guān)察組總有效率為92.08%，復(fù)發(fā)率為9.32%，對(duì)照組總有效率為73.85%，復(fù)發(fā)率為36.92%。兩組均采用了免疫制劑左旋咪唑片，觀(guān)察組加用了rb-bFGF無(wú)菌噴霧劑外用，有效率竟然高出對(duì)照組，與rb-bFGF外用效果有關(guān)。rb-bFGF為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是一種廣泛存在于人體腦內(nèi)和神經(jīng)等組織的生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)蛋白和化學(xué)趨化， 促進(jìn)修復(fù)和再生的作用，對(duì)傷口愈合過(guò)程中所有相關(guān)細(xì)胞的促有絲分裂原，調(diào)節(jié)蛋白和化學(xué)趨化、促進(jìn)組織損傷的修復(fù)，改善局部血液循環(huán)加速創(chuàng)面愈合有促進(jìn)作用[16-17]。

左旋咪唑在治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中是通過(guò)誘導(dǎo)Ⅰ類(lèi)細(xì)胞因子的釋放來(lái)激發(fā)細(xì)胞免疫、降低血清IgE的濃度，增加干擾素的生成量提高機(jī)體免疫力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，左旋咪唑在提高脾細(xì)胞干擾素表達(dá)的同時(shí)，還能調(diào)節(jié)Ⅰ類(lèi)細(xì)胞因子和Ⅱ類(lèi)細(xì)胞因子的相對(duì)關(guān)系，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的平衡，從而改善復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病過(guò)程中Th1、Th2細(xì)胞功能失平衡現(xiàn)象[18]。左旋咪唑還可顯著促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞增殖，使CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞比值明顯升高[19-20]。但單純用左旋咪唑治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍效果不及左旋咪唑配合外用rb-bFGF無(wú)菌噴霧劑治療，可見(jiàn)在治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的過(guò)程中，除改善機(jī)體免疫功能外，消炎、促進(jìn)潰瘍愈合也是非常重要的一步。左旋咪唑片配合外用rb-bFGF無(wú)菌噴霧劑治療既改善了患者免疫功能，又促進(jìn)潰瘍面的愈合，因此治療效果優(yōu)于單純左旋咪唑的治療。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Lewkowicz N，Lewkowicz P，Dzitko K，et al. Dysfunction of CD4+CD25 high T regulatory cells in patients with recurrent aphthous stomatitis[J].J Oral Pathol Med，2008，37（18）： 454-461.

[2]Huling LB，Baccaglini L，Choquette L，et al. Effect of stressful life events on the onset and duration of recurrent aphthous stomatitis[J].J Oral Pathol Med，2012，41（2）：149-152.

[3]Stoopler ET，Sollecito TP.Recurrent Oral Ulcers[J].JAMA，2015，313（23）：2373-2374.

[4]劉志明，張虹，毛甜甜，等.不同藥物治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍效用的回顧性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（21）：3243-3245.

[5]李源媛，王新文.復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：270-273.

[6]樊瑞斌，崔君霞，張虹.復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的局部藥物治療現(xiàn)狀[J].北京口腔醫(yī)學(xué)，2011，19（2）：118-120.

[7]陳茜，王冬平，蔡揚(yáng)，等.復(fù)發(fā)性阿弗它潰瘍患者血清中Th1，Th2類(lèi)因子表達(dá)及意義[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015， 31（6）：826-829.

[8]劉好好，許子悅，謝春雨，等.復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與T細(xì)胞免疫研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2016，36（1）：72-75.

[9]Akintoye SO，Ureenberg MS. Recurrent aphthous stomatitis[J].Dental Clin North America，2014，58：281-297.

[10]Basu R，Hatton RD，Weaver CT. The Th17 family； flexibility follows function[J].Immunol Rev，2013，252（1）：89-103.

[11]Lewkowicz N，Kur B，Kurnatowska A，et al.Expression of Thl-Th2/Th3-Th17-related genes in recurrent aphthous ul ？鄄cers[J].Arch Immunol The Exp（warsz），2011，59（5）：399-406.

[12]Pekiner FN，Aytugar E，Demirel GY，et al.Interleukin-2，interleukin-6 and T regulatory cells in peripheral blood of patients with Behcet′s and disease and recurrent aphthous ulcerations[J].J Oral Pathol Med，2012，41（1）：73-79.

[13]Emoto M，Shimizu T，Koike H，et al. Dissociated expression of natural killer 1.1 and T-cell receptor by invariant natural killer T cells after interleukin-12 receptor and T-cell receptor signalling[J].Immunology，2010，129（1）： 62-74.

[14]Pedersen A，Klaosen B，Hougen HP，et al.T-lymphocyte subsets in recurrent aphthous ulceration[J].J Oral Pathol Med，1989，18（1）：59-60.

[15]Al-Samadi A，Kouri VP，Salem A，et al.IL-17C and its receptor IL-17RA/IL-17RE identify human oral epithelial cell as an inflammatory cell inrecurrent aphthous ulcer[J].J Oral Pathol Med，2014，43（2）：117-124.

[16]羅成.重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍臨床觀(guān)察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46（20）：75-76.

[17]黃敏，黃冬，鄭澤榮.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍165例[J].廣東醫(yī)學(xué)，2006，27（6）：927-928.

[18]Dalghous AM，F(xiàn)reysdottir J，F(xiàn)ortune F.Expression of cytotrines，chemokines，and chemokine receptors in oral ulcers of patients with Behcet′s disease（BD）and recurrent aphthous stomatitis is Th1-associated，although Th2-association is also observed in patients with BD[J].Scand J Rheumatol，2006，35（6）：472-475.

[19]巫志勇，吳建民.內(nèi)外合治治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的臨床觀(guān)察[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（20）：135-136.

[20]商繼仲，張燕，劉占文.中藥和左旋咪唑聯(lián)合治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的療效觀(guān)察[J].上?？谇会t(yī)學(xué)，2010，19（3）：247-249.