黃永敬 陳杰忠 曾繼吾 吳文 張瑞敏 朱從一

摘 要 以10年生‘砂糖橘（Citrus reticulata Blanco）為對象，研究夏梢生長對幼果及果柄離區(qū)的細胞壁降解酶活性、相關基因表達及其脫落的影響。結果表明：夏梢萌發(fā)6 d后幼果大量脫落，15 d后累積落果率高達79.5%，比同期去梢的增加91.7%。夏梢生長明顯促進幼果和離區(qū)中纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的提高，其活性水平與相對落果率均達顯著正相關。果膠（甲）酯酶（PME）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性不受夏梢生長所影響。基因表達結果顯示，夏梢生長促進CsPG、Csβ-Gal和CsCx的表達上調，6 d時出現(xiàn)表達峰值，而CsPME的表達不受夏梢影響。綜合認為‘砂糖橘夏梢生長誘導幼果脫離過程中，Cx、PG是參與脫落調控的細胞壁降解關鍵酶。

關鍵詞 砂糖橘；夏梢；細胞壁降解酶；基因表達；脫落

中圖分類號 S666.2 文獻標識碼 A

Effects of Summer Shoot Growth on Activities and Gene Expression

of the Cell Wall Degradation Enzymes in‘Shatangju

Mandarin Fruitlet and Abscission Zone

HUANG Yongjing1，2， CHEN Jiezhong2 *， ZENG Jiwu1， WU Wen1 *，

ZHANG Ruimin1， ZHU Congyi1

1 Institute of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of South Subtropical

Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture， Guangzhou， Guangdong 510640， China

2 College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

Abstract The objective of this work was to investigate the effects of shoot growth on the activities， gene expression of the cell wall degradation enzymes and abscission of fruitlet and abscission zone（AZ）in Citrus. 10-year old trees of‘Shatangjumandarin（Citrus reticulata Blanco）were used as the material. The results showed that summer shoot obviously increased fruitlet abscission. At the 15th day， the accumulative abscission rate（AAR）in shoot-retained treatment was 79.5%， which was 91.7% higher than that in shoot-removed treatment. Moreover， the activities of cellulase（Cx）and polygalacturonase（PG）in fruitlet and AZ were dramatically increased during the summer shoot growth， and the activities of those two enzymes were positively correlated with the relative abscission rate（RAR）. However， the activities of pectin methylesterase（PME）and β-galactosidase（β-Gal）were not influenced by summer shoot growth. qRT-PCR analysis showed that the expression levels of CsPG， Csβ-Gal and CsCx were significantly upregulated during the summer shoot growth， with the expression peaks were appeared at the 6th day， but a little effect was found in the expression of CsPME. These results suggested that during fruitlet abscission induced by summer shoot growth in‘Shatangjumandarin， Cx and PG were the key cell wall degradation enzymes which regulated fruitet abscission.

Key words Shatangju； summer shoot； cell wall degradation enzymes； gene expression； abscission

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.005

果樹新梢生長誘導幼果脫落的現(xiàn)象比較普遍，已有的研究認為主要是受樹體碳素營養(yǎng)調控的結果。原因是新梢是一個極其強大的代謝庫，其與幼果的碳素營養(yǎng)競爭中處優(yōu)勢地位，幼果遭受碳素營養(yǎng)脅迫后脫落[1-3]。‘砂糖橘（Citrus reticulata Blanco）以無核、易剝皮和品質優(yōu)而著稱，是華南地區(qū)栽培面積最大的柑橘品種?！疤情俚挠坠谌菀壮樯律遥?～7月份抽出，俗稱夏梢），夏梢的抽生必將導致幼果大量脫落[4]。如何有效控制夏梢生長以獲得高產，一直是‘砂糖橘產業(yè)面臨的難題。

植物器官脫落是脫落組織部位-離區(qū)（AZ）細胞的胞間層和細胞壁發(fā)生降解后，黏著力遭破壞而導致遠端器官脫離母體的結果[5]，而胞間層和細胞壁的降解需要細胞壁降解酶的參與[6]。諸多研究證明，參與植物組織脫落調控的細胞壁降解酶主要包括纖維素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠（甲）酯酶（PME）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）等，在不同條件導致的植物器官脫落過程中，這些降解酶均起到不同的調控作用[7-8]。果樹新梢生長導致幼果脫落，在此條件下幼果的細胞壁降解酶活性、相關基因表達如何變化，其與落果的關系等研究尚未見報道。本試驗研究了‘砂糖橘夏梢生長過程中幼果和離區(qū)細胞壁關鍵降解酶活性、相關基因表達水平以及幼果脫落的變化，探討細胞壁降解酶與幼果脫落的關系，旨在為揭示果樹新梢生長誘導幼果脫落機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年4月至2011年12月在廣東省清遠市橫田管理區(qū)高田村柑橘園進行，水田地，酸壤土。供試柑橘品種為10 年生的紅橘砧（Citrus tangerina Hort.ex Tanaka）‘砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv. Shatangju），種植株行距2.5 m×3.0 m，試驗地立地條件一致。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 2011年5月19日夏芽開始萌動，選取60株生長一致的植株進行留（去）梢處理，其中30株樹保留夏梢自然生長以誘導幼果脫落，其余的30株樹通過人工抹除夏梢抑制落果作對照。3次重復，隨機排列，每重復10株樹。每一植株樹冠外圍中部的（離地面1.4～1.8 m）東、西、南、北4個方向選擇掛果量較一致的10條結果枝進行掛牌。抹除全株零星萌發(fā)的夏芽，待掛牌枝條的夏梢統(tǒng)一萌發(fā)時，開始進行留、去梢處理。留梢處理為夏芽抽生后保留其自然生長狀態(tài)，去梢則是每天檢查并抹除新萌發(fā)的夏芽。

于留梢或去梢后的0、3、6、9、12、15 d進行落果率調查和取幼果樣。取幼果樣品時，連同果柄一起摘下，立即用刀片把離區(qū)從果實中切開，分離成幼果樣品和離區(qū)樣品（離區(qū)溢痕上下約2.0 mm處切取的果柄，包含約2.0 mm厚度的幼果和2.0 mm長度的果柄）。樣品用液氮凍存后帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存用于細胞壁降解酶活性及其基因表達量的測定。

1.2.2 落果率的調查 參照Wang等[8]的方法統(tǒng)計幼果的相對落果率和累積落果率。相對落果率（RAR）/（%/d）=[（Nt-1-Nt）/N0·d]×100；累積落果率（AAR）/%=[（N0-Nt）/N0]×100。N0為初始坐果數(shù)量，Nt-1和Nt分別表示前后相鄰2個時期的坐果數(shù)量，d是調查的間隔天數(shù)。

1.2.3 細胞壁降解酶活性的測定 稱取0.75 g柑橘幼果或離區(qū)樣品，冰浴條件下用4 mL酶提取液（0.05 mol/L醋酸緩沖液，內含1 mol/L NaCl、10 g/L PVPP、0.6% EDTA，4 ℃，pH5.5）研磨勻漿20 min，4 ℃下10 000 ×g離心20 min，收集上清液，殘渣再提取1次，合并上清液，得到粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Cx、PG、β-Gal活性采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定[9-10]，以每min產生1 μg葡萄糖、1 μg游離半乳糖醛酸和1 μmol對硝基酚分別定義為一個Cx、PG和β-Gal活力單位。PME活性采用NaOH滴定法測定[11]，以每min釋放的1 μmol CH3O-定義為一個PME活力單位。

1.2.4 RNA提取及實時熒光定量PCR 采用提取試劑盒（北京華越洋公司）提取幼果和離區(qū)的總RNA，DNase I（TaKaRa）去除DNA污染。瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白測定儀檢測RNA質量后，取1 μg RNA用M-MLV反轉試劑盒（Invitrogen）反轉錄合成單鏈cDNA。

根據(jù)Genbank中CsCx（AF000136）、CsPG（EF185420）、CsPME（CSU82976）和Csβ-Gal（AY029198）的基因數(shù)據(jù)信息對目的基因進行引物設計，柑橘看家基因Actin為內參進行定量PCR。具體引物序列如下：CsCx上游5′-AGAGTGAAATGGAAGGGAT-3′；下游5′-TTACAAACCAAGGGAGAAT-3′。CsPG上游5′-CACCATGCGAAGGCTTATTT-3′；下游5′-AGCAAGGAGGCGGTTCTACT-3′；CsPME上游5′-AGAGTGAAATGGAAGGGAT-3′；下游5′-TTACAA

ACCAAGGGAGAAT-3′。Csβ-Gal上游5′-GACGAC

GCTCCTCATCCAGT-3′；下游5′-CTCGGTGAACCA

ACCAGTCC-3′。Actin上游5′-CCAAGCAGCATGAA

GATCAA-3′；下游5′-ATCTGCTGGAAGGTGCTGA

G-3′。

應用Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀（ABI 7500），反應程序采用SYBR Premix Ex Taq（Takara）試劑盒進行反應。擴增體系（20 μL）：SYBRR Green qPCR SuperMix 10 μL，正、反向引物（2.5 μmol/L）各1 μL，模板（cDNA）2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：50 ℃ 120 s；95 ℃ 600 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。3次重復，反應結束后分析熒光值變化曲線以及融解曲線，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理應用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性（p<0.05）及相關性分析，Excel 2003進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 夏梢生長對幼果脫落的影響

調查發(fā)現(xiàn)，‘砂糖橘留梢、去梢的相對落果率均表現(xiàn)為先升高后下降的變化趨勢。夏梢生長6 d后留梢處理的相對落果率均顯著高于去梢處理，9 d時出現(xiàn)落果峰值，落果率是同時期去梢的3.14倍，此后有所下降；而去梢的相對落果率在6 d時達到高峰后就持續(xù)下降（圖1-A）。試驗期間，留梢的累積落果率表現(xiàn)為持續(xù)快速上升之趨勢，9 d后顯著高于去梢處理，15 d時其累積落果率為79.5%，比同期去梢的增加91.7%；而去梢的累積落果率在9 d后增幅日漸緩慢，呈座果穩(wěn)定之趨勢（圖1-B）。說明夏梢生長促進‘砂糖橘幼果大量脫落，而去梢則可抑制幼果脫落從而提高坐果率。

2.2 夏梢生長對細胞壁關鍵降解酶活性的影響

夏梢生長對幼果、離區(qū)中細胞壁降解酶活性的影響見圖2。由圖2-A可以看出，隨著夏梢的抽生，幼果中的Cx活性快速上升，6 d時出現(xiàn)高峰，此時酶活性是去梢的2倍，此后一直維持在較高的水平；試驗期間，去梢幼果中的Cx活性變幅穩(wěn)定，酶活性始終維持在20 U/g FW上下波動；12 d后，無論留梢還是去梢，其酶活性均呈逐漸下降之勢，之后處理間差異不明顯。留梢處理中離區(qū)的Cx活性變化趨勢與幼果中的基本一致，夏梢生長促進離區(qū)中Cx活性的快速上升，其中6～12 d該酶活性同樣顯著高于去梢的，于9 d時出現(xiàn)活性高峰，酶活性是同時期去梢的4.03倍（圖2-B）。

夏梢生長對幼果中PG活性變化如圖2-C所示，夏梢促進PG活性的快速升高，其中6～9 d酶活性水平顯著高于去梢的，之后快速下降；去梢幼果的PG活性雖一度得到快速升高，但6 d后又下降至初始水平，12 d后進一步下降至留梢的水平。離區(qū)中，留梢處理的PG活性變化趨勢與幼果中的基本一致，夏梢生長促進PG活性的迅速上升，于6 d時達到峰值，之后酶活性持續(xù)下降；試驗前期，去梢的PG活性緩慢上升，6～9 d時顯著低于留梢的，之后與留梢的差異不明顯（圖2-D）。

由圖2-E可知，整個試驗期間，留梢、去梢幼果中的PME活性變幅平穩(wěn)，期間留梢處理的PME活性雖一直高于去梢的，但處理間差異不顯著；離區(qū)中的PME活性與果實的基本一致，均表現(xiàn)為緩慢上升后又有所回落的趨勢，處理間差異不顯著（圖2-F）。這說明夏梢生長對幼果、離區(qū)中的PME活性影響不大。留梢生長一度促進幼果中β-Gal活性的緩慢上升，6 d后酶活性呈緩慢下降之勢，而去梢幼果中β-Gal活性總體上變幅穩(wěn)定（圖2-G）。離區(qū)中留梢的β-Gal活性走勢平穩(wěn)，夏梢生長并沒有引起酶活性的劇烈變化，而去梢的β-Gal活性在6～9 d時出現(xiàn)短暫的下降現(xiàn)象（圖2-H）。

2.3 細胞壁降解酶活性與落果率的相關性分析

對細胞壁降解酶活性與落果率的相關性進行分析，結果如表1所示，除PG和β-Gal活性與累積落果率呈負相關外，其余的都與落果率呈正相關。Cx、PG活性與相對落果率的相關性達顯著正相關，其中幼果中Cx活性與相對落果率的相關性達到極顯著正相關，表明Cx、PG活性的升高是促進‘砂糖橘幼果脫落的原因之一。

2.4 夏梢生長對細胞壁關鍵降解酶基因表達的影響

夏梢生長對幼果、離區(qū)中細胞壁降解酶基因表達的影響見圖3。由圖3-A可知，夏梢生長6 d后，幼果中CsCx的表達量迅速上調并達到峰值，表達量為同時期去梢的5.17倍，6～12 d期間表達量顯著高于去梢的，而15 d后處理間差異不明顯。整個試驗期間，去梢處理幼果中CsCx的表達較平穩(wěn)，均維持在0 d時的表達水平上下波動。離區(qū)中CsCx的表達量變化趨勢與幼果中的基本一致，留梢處理于6 d時出現(xiàn)表達高峰，表達量為同時期去梢處理的10.75倍，為同時期留梢幼果中的5.33倍，說明夏梢生長對離區(qū)中CsCx表達量的影響明顯大于幼果中的（圖3-B）。

由圖3-C可知，留梢、去梢幼果中的CsPG表達量均表現(xiàn)為起伏上調之勢，總體上處理間的表達差異并不明顯。但夏梢生長明顯促進離區(qū)中CsPG表達量的迅速上調，3～12 d表達量顯著高于去梢的，于6 d時出現(xiàn)表達峰，表達量是同時期去梢的2.37倍（圖3-D）。表明夏梢生長主要促進離區(qū)中CsPG表達量的上調，而對幼果中的影響甚微。

總體上留梢、去梢對幼果和離區(qū)中CsPME的表達量影響不明顯（圖3-E、F）。試驗期間，留梢、去梢幼果中的CsPME的表達量均表現(xiàn)為逐漸上調之趨勢。留梢、去梢離區(qū)中CsPME的表達量總體上均呈先上調后下降的變化趨勢，留梢的于12 d時出現(xiàn)表達高峰，出峰時間比去梢的相對滯后。

夏梢生長3 d后，幼果中Csβ-Gal表達量的迅速上調，于6 d時出現(xiàn)表達峰，表達量為同時期去梢處理的4.65倍，除第9天外，其余時段的表達量均顯著高于去梢的（圖3-G）。離區(qū)中Csβ-Gal表達量變化趨勢與幼果中的一致，夏梢生長同樣促使離區(qū)中Csβ-Gal的表達量迅速上調，于第6天時出現(xiàn)表達峰值，為同時期去梢處理的6.86倍（圖3-H）。而去梢處理的幼果、離區(qū)中的Csβ-Gal表達量總體表現(xiàn)穩(wěn)定，試驗期間變幅不大。

3 討論

‘砂糖橘夏梢生長促進幼果迅速脫落，夏梢生長6 d后落果加速，15 d后近80%的幼果脫落，至果實成熟時，調查發(fā)現(xiàn)留梢處理的平均單株產量為12.6 kg，僅為去梢處理產量（53.1 kg）的23.7%，表明夏梢生長導致其產量銳減。

Cx通過降解各種葡聚糖聚合物的1，4-β-鍵，從而分解纖維素微絲、幾丁質及蛋白質等復合體，在植物細胞壁降解中起重要作用，是促進幼果脫落的最主要功能酶[13-14]。本試驗結果表明，夏梢生長顯著促進了果實和離區(qū)中的Cx活性及其基因表達水平的提高，進一步分析發(fā)現(xiàn)該酶活性變化趨勢與相對落果率變化趨勢在時間進程上基本一致，相關性分析表明兩者間顯著正相關性（r=0.753**和r=0.700*），這表明Cx在‘砂糖橘夏梢調控幼果脫落過程中起重要作用。邱棟梁等[15]通過人工模擬酸雨的方式誘導龍眼幼果脫落，發(fā)現(xiàn)酸雨脅迫明顯促進幼果的ABA含量和Cx活性的提高，認為酸雨可能通過改變內源激素含量及組成進而調控Cx活性，最終促進龍眼幼果脫落。筆者前期研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[16]，即夏梢生長促進幼果中ABA含量的提高，但ABA、Cx在幼果脫落調控中是否存在關聯(lián)機制，尚有待進一步深入研究。

PG可通過降解大分子底物上非還原末端的單體及清除中性的側鏈殘基，從而水解植物細胞壁及胞間層的果膠物質，或對果膠網(wǎng)狀物解聚作用[17]。已有的研究表明PG活性的升高[7]、或者PG基因表達上調[18]與植物組織脫落進程是相一致的。Jiang等[19]利用病毒誘導基因沉默技術（VIGS）特異性地沉默了番茄中PG表達后，能夠延遲乙烯誘導番茄葉片的脫落和增加葉柄的斷裂力，這證明了PG在調控植物器官脫落過程中的重要性。本試驗中，夏梢生長均促進果實及離區(qū)中PG活性的上升，相關性分析表明酶活性與相對落果率顯著正相關（r=0.659*和r=0.681*），表明PG在‘砂糖橘夏梢生長誘導幼果脫落過程中作用重要。蘋果中，樹冠噴施萘乙酸（NAA）促進落果，而氨基乙氧基乙烯甘氨酸（AVG）則可起抑制落果作用。Zhu等[20]在蘋果中樹冠噴施NAA，然后噴施AVG以抵消NAA的落果效應，發(fā)現(xiàn)蘋果幼果脫落過程中，主要是離區(qū)中的PG表達受影響，而其他部位的PG受影響的程度相對較弱。本研究中也發(fā)現(xiàn)相似結果，即夏梢生長主要促進果柄離區(qū)中CsPG表達量的上調，而對幼果中的影響甚微。

PME加速果膠中的甲酯水解而形成果膠酸和甲醇，PME生理意義可能在于為PG作用準備底物，對果膠物質的降解起輔助作用[21]。PME在器官脫落方面有不同的結論，Wang等[8]應用外源乙烯促進番茄花梗脫落研究，發(fā)現(xiàn)PME活性的升高加速器官脫落，但也有PME與脫落無關[22]的報道，這可能與試驗的材料、條件等不同所致。本試驗發(fā)現(xiàn)，夏梢生長不影響‘砂糖橘幼果和離區(qū)中PME活性的變化，其酶活性與落果率的相關性不顯著，對CsPME的表達量影響也不明顯。因此，‘砂糖橘夏梢生長誘導果實脫落過程中PME的確切作用還需要進一步研究。

β-Gal可降解細胞壁結構從而使其變松弛，其功能主要與果實軟化有關[23]。許多研究已證明，β-Gal與植物組織脫落相關，Wu等[24]在柑橘成熟果實脫落過程中，以及Agustí等[25]在乙烯促進柑橘葉片脫落過程中，均發(fā)現(xiàn)脫落組織中β-Gal的表達水平明顯上調，但作者沒有在生理層面進行相關研究。本試驗發(fā)現(xiàn)，夏梢生長對幼果和離區(qū)中β-Gal活性的影響甚微，酶活性與落果率的相關性亦不顯著，但明顯促進Csβ-Gal的表達上調。

綜合分析，‘砂糖橘夏梢生長誘導幼果脫落過程中，幼果及離區(qū)中Cx、PG的酶活性及基因表達水平得到不同程度的提高，認為它們是參與脫落調控的細胞壁降解關鍵酶。夏梢生長不甚影響β-Gal活性，但明顯促進Csβ-Gal的表達上調，因此認為研究β-Gal參與‘砂糖橘夏梢生長調控幼果脫落機制時，應重點從分子水平上加以解析。夏梢生長不影響PME的活性及其基因表達水平，其作用機理尚待進一步研究。

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