宋天增　任子利　趙彥玲　吳玉江　徐亞歐　孫鋒博

摘要：【目的】研究維生素C對(duì)4 ℃保存藏西北絨山羊精液效果及其全基因組DNA甲基化的影響，為高效利用藏西北絨山羊種公羊精液及推廣其人工授精技術(shù)打下基礎(chǔ)?！痉椒ā考訇幍廊斯げ杉匚鞅苯q山羊種公羊新鮮精液，用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋后添加不同濃度的維生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃保存24 h，觀察統(tǒng)計(jì)其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)精子全基因組DNA甲基化的情況。【結(jié)果】藏西北絨山羊精液4 ℃保存24 h后，以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對(duì)應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3個(gè)指標(biāo)均極顯著高于未添加維生素C的空白對(duì)照組（P<0.01）。添加8.0 mg/mL維生素C的藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平與新鮮精液的接近，均顯著低于未添加維生素C的冷藏精液（P<0.05）。【結(jié)論】原精液中添加2.0 mg/mL維生素C可降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液的全基因組DNA甲基化異常水平，提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。

關(guān)鍵詞： 藏西北絨山羊；精液；維生素C；冷藏；DNA甲基化

中圖分類(lèi)號(hào)： S826.83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）02-0357-04

Abstract：【Objective】This study investigated the effects of vitamin C on Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ and levels of the complete genome DNA methylation， in order to lay a foundation for utilization of ram semen and promotion of artificial insemination technique in the future. 【Method】Fresh semen of ram of Northwest Tibet Cashmere Goat was collected using artificial Vagina. Vitamin C of different concentrations（0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 and 12.0 mg/mL） were added into the semen 4-time diluted with vitamin B12 and preserved at 4 ℃ for 24 hours. Sperm motility， acrosomal integrity and plasma membrabe integrity were observed and complete genome DNA methylation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The Northwest Tibet Cashmere Goat semen after 24 hours preserved at 4 ℃ with 8.0 mg/mL vitamin C showed the best quality. Sperm motility was（73.41±0.47）%， acrosomal integrity（58.89±0.88）% and plasma membrabe integrity（68.76±0.81）%. The three indexes were higher than those of control which added no vitamin C（P<0.01）. At the same time， the level of sperm complete genome DNA methylation was close to that of fresh semen， and significantly lower than those of semen added no vitamin C（P<0.05）. 【Conclusion】Adding 2.0 mg/mL vitamin C in Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ can reduce the level of DNA methylation and increase the quality of sperm preserved at refrigeration temperature.

Key words： Northwest Tibet Cashmere Goat； semen； vitamin C； refrigeration； DNA methylation

0 引言

【研究意義】藏西北絨山羊又稱(chēng)克什米爾山羊（益西多吉等，2009），已完全適應(yīng)高海拔地區(qū)（藏西北）缺氧、無(wú)霜期短、晝夜溫差大、終年無(wú)補(bǔ)飼的惡劣自然條件，且產(chǎn)出的羊絨細(xì)度在14.5±0.5 μm，優(yōu)于我國(guó)其他絨山羊品種（索朗達(dá)等，2015）。近年來(lái)，隨著西藏特色農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)和畜禽良種工程等重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目的啟動(dòng)，國(guó)家畜禽良種補(bǔ)貼等扶持政策相繼落實(shí)，藏西北絨山羊良種需求日益增多，因此人工授精技術(shù)在藏西北絨山羊種公羊的高效利用中也倍受重視?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】維生素C是一種重要、有效的自由基清除劑，具有較強(qiáng)的還原性，參與有機(jī)體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，在畜禽精液的保存過(guò)程中發(fā)揮了重要作用（Jones and Mann，1977；趙憲林，2009）。Singh等（1996）在牛的凍精稀釋液中添加25 mmol/L維生素C，能顯著提高解凍后的精子活力，由原來(lái)的37.5%提高到46.0%。Aurich等（1997）向馬的精液中添加0.9 mg/mL維生素C，發(fā)現(xiàn)維生素C能抑制精子代謝，從而延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間。Sánchez-Partida等（1997）向綿羊凍精解凍液中添加50和100 mmol/L維生素C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解凍后精子的代謝降低，存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，其原因可能是維生素C能有效防止精子磷脂發(fā)生過(guò)氧化，保護(hù)精子免受自由基的危害。趙憲林（2009）在牛精液稀釋液中添加6.0 mg/mL維生素C，測(cè)得解凍后0 h的精子活力與新鮮精液無(wú)明顯差異，表明維生素C添加濃度對(duì)解凍后的牛精子擺動(dòng)幅度及鞭打頻率等影響不明顯。陳宗明等（2012）研究表明，添加3.0 mg/mL維生C可顯著提高貴州黑山羊精液的4 ℃保存效果。鄭自華等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在德保矮馬精液冷凍稀釋液中添加維生素C能有效延長(zhǎng)精子的體外存活時(shí)間。楊波等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在兔精液稀釋液中添加維生素C可提高常溫保存的精液品質(zhì)。任子利等（2016）研究表明，在精液稀釋液中添加維生素C可降低藏豬精子基因組DNA甲基化異常水平，提高藏豬精液4 ℃保存的效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長(zhǎng)期以來(lái)，由于山羊凍精解凍后精子活力和受胎率較低等因素，嚴(yán)重制約了山羊凍精的大面積推廣應(yīng)用。在低溫條件下，液態(tài)的山羊精液代謝水平較低，其保存時(shí)間較常溫更長(zhǎng)，且可應(yīng)用普通冰箱4 ℃保存，經(jīng)濟(jì)方便。因此，進(jìn)一步優(yōu)化液態(tài)精液冷藏保存體系對(duì)提高山羊種公羊的利用率及推廣其人工授精技術(shù)具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在以維生素B12對(duì)藏西北絨山羊進(jìn)行4倍稀釋的基礎(chǔ)上添加不同濃度的維生素C，經(jīng)4 ℃保存24 h后觀察統(tǒng)計(jì)其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，探討維生素C對(duì)藏西北絨山羊精液冷藏效果的影響，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)精子全基因組DNA甲基化的情況，為高效利用藏西北絨山羊種公羊精液及推廣其人工授精技術(shù)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)公羊?yàn)?～5歲的健康藏西北絨山羊種公羊，共9只，假陰道人工采集其新鮮精液，以人用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋。稀釋后精液用8層以上紗布包裹于18 ℃培養(yǎng)箱中平衡2 h，再置于4 ℃下保存24 h。維生素C購(gòu)自上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，考馬斯亮藍(lán)R 250購(gòu)自上海展云化工有限公司、Diff-Quik Stain染液購(gòu)自北京普博斯生物科技有限公司、精子基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司、MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）購(gòu)自美國(guó)Epigentek公司。主要儀器設(shè)備：倒置熒光體視顯微鏡（IX73，奧林巴斯），電熱恒溫水槽（DKB-450A，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），變頻冰箱（BCD-649WDVC，海爾）、DK-S28電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）、UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、Multifuge X3高速低溫離心機(jī)和ELx808吸收光酶標(biāo)儀（美國(guó)）。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 2. 1 維生素C對(duì)4 ℃保存藏西北絨山羊精液品質(zhì)的影響 向維生素B12 4倍稀釋的藏西北絨山羊精液中添加不同濃度的維生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃下保存24 h后觀察統(tǒng)計(jì)其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，探析添加維生素C對(duì)4 ℃保存藏西北絨山羊精液品質(zhì)的影響。3次重復(fù)。

1. 2. 2 維生素C對(duì)4 ℃保存藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響 根據(jù)1.2.1篩選出維生素C最佳添加濃度組（A），同時(shí)設(shè)新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同處理組的精子全基因組DNA甲基化情況，探析維生素C對(duì)4 ℃保存藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響。3次重復(fù)。

1. 3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1. 3. 1 精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率測(cè)定 精子活力常規(guī)性狀參照林嘉鵬等（2015）、唐淑紅等（2015）的方法進(jìn)行檢查，精子頂體完整率和精子質(zhì)膜完整率參照胡傳活等（2015）的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1. 3. 2 精子全基因組 DNA甲基化水平檢測(cè) 采用精子基因組DNA提取試劑盒提取不同處理組的精子全基因組DNA，以UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶的清晰度和整齊性。同時(shí)，參照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算藏西北絨山羊精液樣品的DNA甲基化水平。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，再以SPSS 11.5進(jìn)行One-way ANOVA方差分析及Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 維生素C對(duì)藏西北絨山羊精液4 ℃保存效果的影響

由表1可看出，藏西北絨山羊精液經(jīng)4 ℃保存24 h后，添加維生素C處理組的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率均高于空白對(duì)照組，且隨著維生素C添加濃度的增加，精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。其中，以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對(duì)應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89± 0.88）%和（68.76±0.81）%，3個(gè)指標(biāo)均極顯著高于未添加維生素C的空白對(duì)照組（P<0.01）。

2. 2 藏西北絨山羊精子基因組DNA純度檢測(cè)結(jié)果

以UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別檢測(cè)維生素C最佳添加濃度（8.0 mg/mL）組（A）、新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）的藏西北絨山羊精子全基因組DNA，結(jié)果表明，藏西北絨山羊精子全基因組DNA濃度為325±10 ng/μL、純度為1.9～2.0，DNA瓊脂凝膠電泳條帶整齊、清晰、單一（圖1）。將待檢藏西北絨山羊精子全基因組DNA稀釋至100 ng/μL后備用。

2. 3 維生素C對(duì)藏西北絨山羊精子基因組DNA甲基化的影響

2. 3. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 參照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）的說(shuō)明，以5-甲基胞嘧啶（5-mC，50%）含量為橫坐標(biāo)、相對(duì)熒光單位為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），擬合得到回歸方程：y=1127.6x+128.8（R2=0.9978）。由圖2可看出，擬合的回歸方程線性關(guān)系良好，可用于計(jì)算5-mC含量及DNA甲基化水平。

2. 3. 2 維生素C對(duì)藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平的影響 維生素C最佳添加濃度（8.0 mg/mL）組（A）、新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）的藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平如圖3所示，以C組的DNA甲基化水平最高，顯著高于A組和B組（P<0.05），而A組與B組差異不顯著（P>0.05）。表明添加8.0 mg/mL維生素C可有效降低低溫（4 ℃）對(duì)藏西北絨山羊精子DNA甲基化的影響，改善藏西北絨山羊精液低溫冷藏的效果。

3 討論

本研究結(jié)果表明，隨著維生素C添加量的增加，4 ℃保存藏西北絨山羊精液的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率指標(biāo)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（拋物線），其中以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對(duì)應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3個(gè)指標(biāo)均極顯著高于其他處理組。本研究在添加維生素C前先用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋?zhuān)喈?dāng)于原精液中的維生素C最佳添加量為2.0 mg/mL，與陳宗明等（2012）在原精液中添加3.0 mg/mL維生素C可顯著提高云貴高原4 ℃保存貴州黑山羊精液冷藏效果的結(jié)果基本一致。相差的1.0 mg/mL添加量可能與所處環(huán)境大氣壓、含氧量、環(huán)境濕度等影響冷藏產(chǎn)生的活性氧有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

Benchaib等（2005）將人類(lèi)精子經(jīng)免疫組化染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在輔助生殖過(guò)程中的精子全基因組DNA甲基化水平可作為研究人類(lèi)精子是否具有受孕能力的一種新方法。人類(lèi)精子DNA片段化與全基因組DNA甲基化間存在負(fù)相關(guān)，添加抗氧化劑可減少DNA損傷且確保精子DNA甲基化狀態(tài)正常（Tunc and Tremellen，2009）。本研究結(jié)果表明，添加8.0 mg/mL維生素C可有效降低低溫（4 ℃）保存環(huán)境對(duì)藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響，改善藏西北絨山羊精液低溫冷藏的效果，與任子利等（2016）在藏豬精液稀釋液中添加維生C可降低藏豬精子基因組DNA甲基化異常水平，提高藏豬精液4 ℃環(huán)境保存的效果一致。說(shuō)明維生素C對(duì)藏西北絨山羊精子全基因組DNA具有較強(qiáng)的還原性，可清除因冷藏產(chǎn)生的自由基（Jones and Mann，1977；趙憲林，2009），還可有效防止精子磷脂發(fā)生過(guò)氧化，降低基因組DNA甲基化水平，保護(hù)精子免受自由基的危害。

4 結(jié)論

原精液中添加2.0 mg/mL維生素C可降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液的全基因組DNA甲基化異常水平，提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。

參考文獻(xiàn)：

陳宗明，密?chē)?guó)輝，許厚強(qiáng)，張勇，趙明富，陳祥. 2012. 維生素C對(duì)貴州黑山羊低溫保存精液品質(zhì)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（6）：146-147.

Chen Z M，Mi G H，Xu H Q，Zhang Y，Zhao M F，Chen X. 2012. Effects of vitamin C on the cryopreserved semen quality of Guizhou black goat[J]. Guizhou Agricultural Science，40（6）：146-147.

胡傳活，許春榮，陸媚，韋干顯，劉德玉，王英群，彭夏云，韋永強(qiáng). 2015. 黃芪多糖對(duì)豬精液低溫保存的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，35（1）：150-154.

Hu C H，Xu C R，Lu M，Wei G X，Liu D Y，Wang Y Q，Peng X Y，Wei Y Q. 2015. Effects of astragalan on low temperature preservation of boar semen[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，35（1）：150-154.

林嘉鵬，唐淑紅，吳陽(yáng)升，汪立芹，黃俊成. 2015. IGF-I對(duì)綿羊冷凍精液質(zhì)量的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，46（3）：498-502.

Lin J P，Tang S H，Wu Y S，Wang L Q，Huang J C. 2015. Effects of IGF-Ι on quality traits of sheep cryopreserved ovine semen[J]. Journal of Southern Agriculture，46（3）：498-502.

任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商鵬，強(qiáng)巴央宗. 2016. 維生素C對(duì)藏豬精液4 ℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，47（5）：1057-1061.

Ren Z L，Zhao Y L，Wang J Z，Li Y X，Shang P，Chamba Yangzom. 2016. Effect of vitamin C on Tibetan boar semen preserved at 4 ℃ and levels of the sperm global genome DNA methylation[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，47（5）：1057-1061.

索朗達(dá)，吳玉江，巴貴，次仁德吉，德吉，益西多吉. 2015. 影響藏西北絨山羊羊絨品質(zhì)的主要因素[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，36（10）：81-83.

Suolangda，Wu Y J，Bagui，Cirendeji，Deji，Yixiduoji. 2015. Main factors influencing cashmere quality of northwest Tibet cashmere goat[J]. Animal Husbandry and Feed Science，36（10）：81-83.

唐淑紅，林嘉鵬，吳陽(yáng)升，汪立芹，黃俊成. 2015. 谷胱甘肽（GSH）對(duì)綿羊細(xì)管凍精質(zhì)量的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，27（5）：79-83.

Tang S H，Lin J P，Wu Y S，Wang L Q，Huang J C. 2015. Effect of GSH on quality of cryopreserved ovine semen[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（5）：79-83.

楊波，蔡繆熒，張昊，程國(guó)虎，張佳慧. 2014. 維生素C對(duì)新西蘭白兔精液常溫保存的影響[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，（5）：40-42.

Yang B，Cai M Y，Zhang H，Cheng G H，Zhang J H. 2014. Effect of vitamin C on New Zealand white rabbit semen preserved at room temperature[J]. Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，（5）：40-42.

益西多吉，尼珍，索朗達(dá)，吳玉江，巴貴，次仁德吉. 2009. 藏西北絨山羊產(chǎn)絨性能研究[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物，29（2）：69-70.

Yixiduoji， Nizhen， Suolangda， Wu Y J， Bagui， Cirendeji. 2009. Study on cashmere production performance of Northwest Tibet Cashmere Goat[J]. China Herbivore，29（2）：69-70.

趙憲林. 2009. 三種維生素對(duì)牛冷凍精液品質(zhì)的影響[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).

Zhao X L. 2009. Effects of three vitamins on quality semen of cattle after freeze-thawing[D]. Yangling：Northwest A & F University.

鄭自華，趙海峰，陳寶劍，陳東峰，蔣欽楊，陸鳳花，陳集成，韋英明. 2014. 精液稀釋液中添加維生素E或維生素C對(duì)德保矮馬精液冷凍效果的影響[J]. 中國(guó)畜牧雜志，50（1）：21-24.

Zheng Z H，Zhao H F，Chen B J，Chen D F，Jiang Q Y，Lu F H，Chen J C，Wei Y M. 2014. The effects of vitamin E or vitamin C supplemented in the frozen semen dilution on Debao pony semen cryopreservation[J]. Chinese Journal of Animal Science， 50（1）：21-24.

Aurich J E，Sch■nherr U，Hoppe H，Aurich C. 1997. Effects of antioxidants on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen[J]. Theriogenology，48（2）：185-192.

Benchaib M，Braun V，Ressnikof D，Lornage J，Durand P，Niveleau A，Guérin J F. 2005. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results[J]. Human Reproduction，20（3）：768-773.

Jones R，Mann T. 1977. Damage to ram spermatozoa by peroxidation of endogenous phospholipids[J]. Journal of Reproduction and Fertility，50（2）：261-268.

Sánchez-Partida L G，Setchell B P，Maxwell W M. 1997. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa[J]. Reproduction，F(xiàn)ertility，and Development，9（7）：689-696.

Singh B，Chand D，Singh P，Yadran N. 1996. Effect of vitamin C addition to the diluent on the quality of deep frozen murrah buffalo bull（Bubalus bubalis） semen[J]. International Journal Animal Science，11：131-132.

Tunc O，Tremellen K. 2009. Oxidative DNA damage impairs global sperm DNA methylation in infertile men[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics，26（9-10）：537-544.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）