夏耘 余德光 謝駿 王廣軍 郁二蒙 謝瑞濤

摘要：【目的】評價不同養(yǎng)殖方式對鳙腸道微生物菌群種類及其多樣性的影響，為發(fā)展鳙的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)?！痉椒ā吭O(shè)生物絮團(tuán)組、施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組3種養(yǎng)殖方式，經(jīng)過8周的飼養(yǎng)周期后，運用PCR-DGGE對不同養(yǎng)殖方式下鳙腸道定植菌進(jìn)行比較分析?！窘Y(jié)果】鳙腸道細(xì)菌多樣性排序為生物絮團(tuán)組>施肥組>網(wǎng)箱吊養(yǎng)組，其中，生物絮團(tuán)組與施肥組、生物絮團(tuán)組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組、施肥組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組的DGGE圖譜相似性依次為53.8%、39.4%和42.8%。生物絮團(tuán)組鳙腸道的特異條帶代表α-亞群的葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、綠彎菌（Chloroflexi）和幾類不可培養(yǎng)細(xì)菌（EU585886.1、FN824844.1、GU498473.1、GU486235.1和JN399992.1）；施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組鳙腸道的特異條帶代表梭菌屬（Clostridium）、氣單胞菌屬（Aeromonas）及不可培養(yǎng)細(xì)菌（EU376178.1）?！窘Y(jié)論】生物絮團(tuán)的應(yīng)用能有效增強(qiáng)養(yǎng)殖鳙腸道微生物菌群組成多樣性，降低氣單胞菌在鳙腸道的分布，可作為高蛋白餌料類型被鳙攝食。

關(guān)鍵詞： 鳙；腸道；細(xì)菌群落；生物絮團(tuán)；養(yǎng)殖方式；PCR-DGGE

中圖分類號： S965.114 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0907-06

Effects of different aquaculture models on intestinal bacterial

community of bighead carp（Aristichthys nobilis）

XIA Yun1，2， YU De-guang 1， XIE Jun1*， WANG Guang-jun1， YU Er-meng 1， XIE Rui-tao 2

（1 Pearl River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences / Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation， Ministry of Agriculture， Guangzhou 510380， China； 2 Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524025， China）

Abstract：【Objective】The present study was carried out to evaluate the effects of different aquaculture models on intestinal bacteria composition and diversity of Aristichthys nobilis， to provide reference for healthy culture of it. 【Method】A feeding trial was carried out for eight weeks， and was divided into three groups： biofloc group， fertilization group and cage hanging group. The intestinal colonization bacteria of A. nobilis which were cultivated in three different models was compared by PCR-DGGE technology. 【Result】Results showed that the order of intestinal bacteria diversity followed as biofloc group>fertilization group>cage hanging group， and the DGGE map similarities between biofloc group and fertilization group， biofloc group and cage hanging group， fertilization group and cage hanging group were 53.8%， 39.4% and 42.8% respectively. Specific bands in biofloc group represented Gluconacetobacter， Staphylococcus， Chloroflexi and some uncultured bacteria（EU585886.1， FN824844.1， GU498473.1， GU486235.1 and JN399992.1） of α-subset. Specific bands in fertilization group and cage hanging group were Clostridium， Aeromonas and uncultured bacteria（EU376178.1）. 【Conclusion】The application of biofloc enhances the diversity of intestinal microflora composition in A. nobilis， and reduces the distribution of Aeromonas in A. nobilis intestine. Biofloc can also be used as one kind of high protein bait for A. nobilis.

Key words： Aristichthys nobilis； intestine； bacterial community； biofloc； culture model； PCR-DGGE

0 引言

【研究意義】鳙（Aristichthys nobilis）又名胖頭魚、大頭魚、花鰱，主要以浮游動植物為食，是四大家魚之一，也是池塘水質(zhì)調(diào)節(jié)的重要品種（嚴(yán)駿驄等，2011）。近年來，隨著對鳙養(yǎng)殖高效益的追求，在高密度的養(yǎng)殖條件下其病害發(fā)生率居高不下，尤其以暴發(fā)性細(xì)菌性敗血癥最嚴(yán)重。因此，如何提高鳙自身免疫力及抗病能力成為養(yǎng)殖過程中倍受關(guān)注的熱點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】魚類腸道細(xì)菌群落組成在食物消化及抑制腸道病原菌定植方面發(fā)揮著重要作用（Manzano et al.，2012）。腸道菌群生態(tài)平衡決定了宿主的健康狀態(tài)，通過刺激免疫系統(tǒng)，協(xié)助機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對病原菌的侵襲起到屏障作用，并產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，如維生素和短鏈脂肪酸等（Gaggìa et al.，2010）。魚類腸道細(xì)菌群落的組成受多種因素影響，包括養(yǎng)殖環(huán)境和攝食類型（Batista et al.，2016）。攝食類型對塑造腸道菌群和改變關(guān)鍵共生菌的代謝與規(guī)模起主導(dǎo)作用，進(jìn)而引起宿主生物學(xué)的改變（Brown et al.，2012）。長期以來，人們主要通過餌料種類選擇及餌料添加劑應(yīng)用來改善水產(chǎn)動物腸道菌群的分布狀況，促進(jìn)養(yǎng)殖對象的健康生長（Merrifield et al.，2010）。Bakke- McKellep等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在大西洋鱈魚餌料中添加豆粕可提高其腸道微生物組成多樣性，但同時伴有腸炎發(fā)生；Arkadios等（2010）研究證實，餌料中添加豆粕能有效改變金頭鯛腸道細(xì)菌群落構(gòu)成，但在生長發(fā)育方面無明顯差異；Yang等（2012）研究表明，餌料中添加芽孢桿菌可調(diào)節(jié)石斑魚腸道微生物菌群，能選擇性刺激各種潛在益生菌（腸球菌屬和短小芽孢桿菌）的生長，進(jìn)而抑制一些有害菌（葡萄球菌和弧菌）的生長；He等（2013）研究表明，餌料中添加低劑量芽孢桿菌能改變羅非魚腸道菌群組成，有利于羅非魚機(jī)體的健康發(fā)育；Batista等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，在以植物蛋白替換掉部分動物蛋白的條件下，添加益生菌能改變?nèi)麅?nèi)加爾鰨的腸道菌群組成，進(jìn)而改善機(jī)體免疫能力?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，生物絮團(tuán)作為一種特殊的養(yǎng)殖技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在養(yǎng)殖水質(zhì)改善及養(yǎng)殖對象餌料替代方面發(fā)揮重要作用（Hari et al.，2004；Avnimelech，2007）。生物絮團(tuán)是以異養(yǎng)微生物為主，經(jīng)生物絮凝作用結(jié)合水體中的有機(jī)質(zhì)、原生動物、藻類等而形成的絮狀物，可作為濾食性魚類的一種新型餌料（李朝兵等，2012），但有關(guān)攝食生物絮團(tuán)對鳙腸道細(xì)菌群落組成的影響尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】將生物絮團(tuán)、施肥、網(wǎng)箱吊養(yǎng)等3種養(yǎng)殖方式應(yīng)用于鳙的養(yǎng)殖，從其腸道微生物菌群種類及其多樣性出發(fā)，評價不同養(yǎng)殖方式對鳙腸道微生物菌群種類及多樣性的影響，為發(fā)展鳙的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品準(zhǔn)備

試驗于2015年9～10月在廣東省中山食品水產(chǎn)進(jìn)出口集團(tuán)有限公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行，共8周。供試鳙規(guī)格為15.00±0.59 g，放養(yǎng)密度30尾/池，共270尾。養(yǎng)殖水源為同一養(yǎng)殖基地主養(yǎng)草魚的池塘表層水，使用前以40目篩絹過濾，水體總固體懸浮物（TSS）維持在18.30 mg/L。水源水質(zhì)參數(shù)為氨氮（NH4+-N）0.58±0.02 mg/L，亞硝酸鹽氮（NO2--N）0.03±0.01 mg/L，硝酸鹽氮（NO3--N）0.71±0.03 mg/L。養(yǎng)殖水體浮游動物種類主要有輪蟲、枝角類和橈足類等，含量為3～5 ind/L。

1. 2 試驗設(shè)計

共設(shè)3種養(yǎng)殖方式。（1）生物絮團(tuán)組：在水泥池（10 m3）中注入8 m3的養(yǎng)殖水源水，用100 μm篩絹收集生物絮團(tuán)，調(diào)節(jié)TSS濃度至100.00 mg/L，整個養(yǎng)殖過程不換水，每隔7 d對水體TSS濃度進(jìn)行調(diào)整。（2）施肥組：在水泥池（10 m3）中注入8 m3的養(yǎng)殖水源水，潑灑尿素7 g（N 46%）和過磷酸鈣3 g（P2O5 16%）培養(yǎng)水體浮游動物量至8～10 ind/L，每隔7 d鏡檢一次，并調(diào)整水體浮游動物量；每隔15 d更換10%養(yǎng)殖用水。（3）池塘網(wǎng)箱吊養(yǎng)組：在草魚養(yǎng)殖池塘上層（1 m）懸掛網(wǎng)目為2.5～3.0 cm的網(wǎng)箱（3 m×3 m），每隔7 d鏡檢一次水體浮游動物量，維持在3～5 ind/L。試驗結(jié)束后停食24 h，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)取3尾鳙（郁二蒙等，2012）。

1. 3 樣品基因組總DNA提取與測定

鳙腸道樣品采集不分段，解剖后以0.65%無菌生理鹽水沖洗一次腸內(nèi)壁，去除內(nèi)容物，腸壁置于2 mL滅菌EP管中，-40 ℃保存?zhèn)溆茫◤堈衲械龋?015）。將每個養(yǎng)殖單元內(nèi)的3份鳙腸道制成混合樣品。腸道細(xì)菌基因組DNA提取參照Bacterial DNA Kit說明進(jìn)行操作，并在初始樣品處理時加入15% SDS裂解細(xì)胞。檢測DNA濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及DGGE分析

參照張振男等（2015）的方法對樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DGGE分析；并參照王峰等（2004）的方法，采用BIO-RAD Quantity One進(jìn)行圖像分析。

1. 5 條帶切膠回收、克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

DGGE條帶的切割回收、克隆及序列分析參照張振男等（2015）的研究方法進(jìn)行操作。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對后，得到的相關(guān)序列信息通過ClustalX進(jìn)行多序列對位排列（Thompson et al.，1997），經(jīng)校對和剪切后采用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Kumar et al.，2004）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可看出，9個鳙腸道樣品的基因組DNA均已提取獲得，其分子量約為23 kb，與細(xì)菌基因組DNA的大小相同，即提取獲得的DNA屬于較完整的細(xì)菌基因組DNA，亮度和純度均較好，無拖尾現(xiàn)象，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和DGGE分析。以提取的鳙腸道菌群總DNA為模板，能擴(kuò)增獲得200 bp的16S rDNA-V3區(qū)片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。

2. 2 DGGE指紋圖譜及分析結(jié)果

鳙腸道菌群16S rDNA-V3區(qū)片段的DGGE指紋圖譜如圖3所示。3個處理組的樣品分別在DGGE指紋圖譜上產(chǎn)生31、28和25條可鑒別條帶，條帶數(shù)量能反映鳙腸道細(xì)菌的多樣性程度，說明生物絮團(tuán)的應(yīng)用有利于提高鳙腸道菌群種類多樣性。鳙腸道細(xì)菌多樣性排序為生物絮團(tuán)組>施肥組>網(wǎng)箱吊養(yǎng)組，但各處理組鳙腸道細(xì)菌群落的優(yōu)勢種十分明顯，均有10條左右的條帶（對應(yīng)于DGGE泳道中的亮條帶）。

PCR-DGGE指紋圖譜經(jīng)BIO-RAD Quantity One分析后得到UPMGA聚類圖（圖4）。9個鳙腸道樣品按其相似性程度聚為三簇，即每個處理組聚為一簇，相似性均為100.0%；生物絮團(tuán)組和施肥組先聚為一大簇，再與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組匯聚。進(jìn)一步分析各處理組鳙腸道微生物多樣性，結(jié)果（表1）顯示，生物絮團(tuán)組與施肥組、生物絮團(tuán)組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組、施肥組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組的DGGE圖譜相似性依次為53.8%、39.4%和42.8%。

2. 3 DGGE目的條帶基因片段克隆測序及比對分析結(jié)果

共對10條DGGE特異性條帶進(jìn)行切割，切割的條帶如圖3所示（三角形標(biāo)注）。其中，條帶B1、B2、B3、B4、B7、B8和B10為生物絮團(tuán)組鳙腸道特異性條帶，條帶B5、B6和B9為施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組鳙腸道特異性條帶。獲得的10個陽性克隆測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行檢索和同源性比對分析，結(jié)果表明，測得的條帶序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列的同源性均在97%以上（表2）。一般認(rèn)為16S rDNA序列同源性大于98%時即為同種細(xì)菌。但由于本研究的克隆片段較短（200 bp），無法精確到種，只能認(rèn)為是同屬范疇。

由基于16S rDNA-V3區(qū)片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）可看出，10個陽性克隆序列所代表的物種來源十分廣泛，包括變形菌門（Proteobacteria）的α-亞群和γ-亞群、綠彎菌綱（Chloroflexi）、梭菌綱（Clostridia）和芽孢桿菌綱（Bacilli）的細(xì)菌，以及一些未知的不可培養(yǎng)細(xì)菌。與這10個陽性克隆序列最相似的序列來源于以下幾個屬：氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）和葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）。其中，葡萄球菌屬、葡糖醋桿菌屬、綠彎菌和幾類未知細(xì)菌為生物絮團(tuán)組鳙腸道特異性條帶所代表的菌株，梭菌屬、氣單胞菌屬及某些未知菌屬為施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組鳙腸道特異性條帶所代表的菌株。

3 討論

DGGE是從環(huán)境中直接提取細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測，因此可繞過培養(yǎng)環(huán)節(jié)，而且采用16S測序和基因庫比對的方式可快速確定細(xì)菌種屬，節(jié)省檢測時間（王琳等，2015）。近年來，PCR-DGGE已廣泛應(yīng)用于魚類及其他水生生物的腸道菌群組成和某一類細(xì)菌數(shù)量研究（李可俊等，2007；羅鵬等，2009）。從本研究的DGGE指紋圖譜可看出，不同養(yǎng)殖方式下鳙腸道存在大量的共性條帶，且這些條帶所占比例較高，由于樣品前期處理時采用生理鹽水沖洗腸道外壁和內(nèi)容物，最終獲得的鳙腸道內(nèi)壁黏膜細(xì)菌群落被認(rèn)為是鳙腸道的定植菌。其中，生物絮團(tuán)組與施肥組的相似性系數(shù)為53.8%，生物絮團(tuán)組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組的相似性系數(shù)為39.4%，施肥組與網(wǎng)箱吊養(yǎng)組的相似性系數(shù)為42.8%。養(yǎng)殖水體環(huán)境和餌料組成等因素對養(yǎng)殖對象腸道的細(xì)菌群落組成有明顯影響（周文豪等，1998；李可俊等，2007；羅鵬等，2009）。本研究采用的養(yǎng)殖水源相同，外界環(huán)境對鳙腸道菌群的影響具有類似效果，因此菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定程度的相似性。同組不同重復(fù)間的養(yǎng)殖管理與流程完全一致，且每個重復(fù)取3尾鳙的腸道制成混合樣品，一定程度上削弱了個體間的差異，保證每處理組3個重復(fù)樣品的DGGE指紋圖譜均比較一致的產(chǎn)生相應(yīng)普帶，其中生物絮團(tuán)組鳙腸道的DGGE條帶數(shù)目最多，為31條；網(wǎng)箱吊養(yǎng)組相對較少，為25條?？梢?，生物絮團(tuán)的應(yīng)用有利于提高鳙腸道菌群種類多樣性。

本研究未對3個處理組存在的大量共性條帶進(jìn)行克隆測序分析，這些共性條帶可能代表魚類腸道中一些常見的細(xì)菌種類，如變形菌、大腸桿菌和芽孢桿菌等；而將研究焦點集中在不同養(yǎng)殖方式下的鳙腸道特異優(yōu)勢細(xì)菌群落構(gòu)成分析，結(jié)果顯示，生物絮團(tuán)組鳙腸道特異性條帶所代表的菌群主要有α-亞群的葡糖醋桿菌屬、葡萄球菌屬及綠彎菌綱。其中，葡糖醋桿菌屬菌株通常具有固氮作用，并能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素（馮靜等，2009）。此外，生物絮團(tuán)組鳙腸道的特異性條帶B1克隆測序結(jié)果顯示為葡萄球菌屬，與趙慶新和譚遠(yuǎn)德（2001）通過傳統(tǒng)計數(shù)法在鳙腸道中未檢測到葡萄球菌屬的結(jié)論存在差異，同時說明生物絮團(tuán)的應(yīng)用對葡萄球菌屬菌株有明顯影響。葡萄球菌屬菌株一般來源于養(yǎng)殖對象居住環(huán)境或攝食餌料（Apun et al.，1999；Zmyslowska et al.，2001），故推測本研究中葡萄球菌屬的存在來源于生物絮團(tuán)，因此有必要從應(yīng)用層面對生物絮團(tuán)進(jìn)行深入調(diào)控與研究。

本研究中，特異性條帶B5和B6為施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組鳙腸道的特異性條帶，序列比對分析結(jié)果顯示，條帶B5與GenBank數(shù)據(jù)庫中不可培養(yǎng)梭菌屬（JF733419.1）的同源性達(dá)99%，條帶B6與氣單胞菌屬（JN032352.1）的同源性為99%。氣單胞菌屬為鯉科魚類腸道中的廣譜性共生菌（趙慶新和譚遠(yuǎn)德，2001），是淡水魚類胃腸中的主要兼性厭氧菌之一。祭仲石等（2014）在南太湖湖州水域鳙腸道中也檢測到氣單胞菌屬菌株的存在。雖然在正常的水產(chǎn)動物腸道壁均能檢測到氣單胞菌屬菌株的存在（Ring■ et al.，2006；Roeselers et al.，2011），但氣單胞菌屬中的一些種類仍是潛在的致病菌（Wu et al.，2012）。從本研究結(jié)果可知，氣單胞菌屬是施肥組和網(wǎng)箱吊養(yǎng)組鳙腸道特異性條帶所代表的細(xì)菌，且為這兩組鳙腸道的優(yōu)勢和次優(yōu)勢種類，進(jìn)一步佐證生物絮團(tuán)的應(yīng)用能有效降低鳙腸道中的氣單胞菌屬菌株分布量，進(jìn)而減少發(fā)病概率。

4 結(jié)論

生物絮團(tuán)的應(yīng)用能有效增強(qiáng)養(yǎng)殖鳙腸道微生物菌群組成多樣性，降低氣單胞菌在鳙腸道的分布，可作為高蛋白餌料類型被鳙攝食。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）