李大紅 劉宏偉 秦蘭娟 崔文藝 李偉 李春枝 宋麗 李鴻雁

摘要：【目的】分析轉(zhuǎn)擬南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS1）基因羽衣甘藍的耐鹽性，為獲得較強的耐鹽性羽衣甘藍品種及其抗逆育種提供理論依據(jù)。【方法】將擬南芥P5CS1基因（AtP5CS1）經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入羽衣甘藍植物中，在鹽脅迫下，分別檢測轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的AtP5CS1 mRNA表達量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性狀、整株干質(zhì)量和鮮質(zhì)量、葉片相對水含量、葉片電導(dǎo)率和整株存活率?！窘Y(jié)果】在150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表達，與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系Y1、Y2的主根和最長側(cè)根長度較長，側(cè)根數(shù)目較多，整株干質(zhì)量和鮮質(zhì)量較重；而且相對水含量顯著高于對照植株（P<0.05，下同），脯氨酸含量及存活率均極顯著高于對照植株（P<0.01），葉片相對電導(dǎo)率顯著低于對照植株?！窘Y(jié)論】轉(zhuǎn)AtP5CS1基因植株的耐鹽表型優(yōu)于對照，即AtP5CS1基因在羽衣甘藍中的表達明顯改善了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

關(guān)鍵詞： 羽衣甘藍；擬南芥；△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）；脯氨酸；耐鹽性

中圖分類號： S635.9 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0768-06

Salt tolerance strengthening of Brassica oleracea var. acephala f. tricolor genetically modified by P5CS1 gene from

Arabidopsis thaliana

LI Da-hong 1， LIU Hong-wei2， QIN Lan-juan3， CUI Wen-yi1， LI Wei1，

LI Chun-zhi4， SONG Li1， LI Hong-yan1 *

（1 School of Biotechnology and Food Engineering Huanghuai University， Zhumadian， Henan 463000， China； 2 Green Department of Zhumadian， Zhumadian， Henan 463000， China； 3 Nanhai Park of Zhumadian， Zhumadian， Henan 463000， China； 4 Zhumadian Landscaping Architecture & Research Institute， Zhumadian，Henan 463000， China）

Abstract：【Objective】Salt tolerance of Brassica oleracea var. acephala f. tricolor after being transferred with △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase（P5CS1） gene from Arabidopsis thaliana was analyzed， in order to obtain slat-tolerant B. oleracea var. acephala f. tricolor varieties and provide reference for breeding for stress tolerance. 【Method】P5CS1 gene from A. thaliana was transferred into B. oleracea var. acephala f. tricolor via Agrobacterium. Under salt stress，expression of P5CS1 mRNA， proline content in seedlings， root traits， dry weight of whole plant，fresh weight of whole plant，relative water content in leaf， relative electric conductivity of leaf and whole plant survival rate in transgenic plants and wild plants were measured. 【Result】Under 150 mmol/L NaCl stress， P5CS1 mRNA of transgenetic plants was in normal expression. Compared with control， main roots and the longest lateral roots of transgenic plants Y1 and Y2 were long， lateral roots were abundant， dry weights and fresh weights of whole plant were heavy. Their relative water contents were significantly higher than that of control（P<0.05， the same below）， proline contents and survival rates were extremely significantly higher than that of control（P<0.01）， but relative electric conductivity of leaf was significantly lower than that of control. 【Conclusion】Salt tolerance of plants genetically modified by AtP5CS1 was better than control. AtP5CS1 gene expression significantly improves salt tolerance of transgenic plants in B. oleracea var. acephala f. tricolor.

Key words： Brassica oleracea var. acephala f. tricolor； Arabidopsis thaliana； △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase（P5CS）； proline； salt tolerance

0 引言

【研究意義】滲透脅迫（如鹽或干旱）嚴(yán)重影響植物生長及其產(chǎn)量。植物的抗逆機制之一是其可產(chǎn)生一些如脯氨酸和甘氨酸等低分子量滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)（Greenway and Munns，1980）。脯氨酸可作為滲透保護劑對細(xì)胞的滲透平衡起重要調(diào)節(jié)作用，能增加細(xì)胞膨壓，對細(xì)胞進行必要的保護。脯氨酸是唯一已被證明可清除單線態(tài)氧和自由基（包括OH-）的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也可調(diào)節(jié)氧化還原電位、保護大分子（如蛋白質(zhì)、DNA）和降低由干旱、鹽或其他脅迫引起的酶變性（Kumar et al.，2010）?！?-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸合成限速酶。脯氨酸在高等植物中的積累表現(xiàn)為合成增加或分解減少，其中，脯氨酸生物合成增加必需要增強P5CS活性（Yamchi et al.，2007）。因此，植物體內(nèi)轉(zhuǎn)入P5CS基因，可能會增加P5CS含量并提高植物的抗逆性?！厩叭搜芯窟M展】已有研究顯示，將外源P5CS基因轉(zhuǎn)入其他植物體內(nèi)，可一定程度上提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱、耐鹽和耐寒等抗逆性。Igarashi等（1997）研究表明，鹽脅迫下水稻抗鹽品種的OsP5CS mRNA表達量和脯氨酸積累量均增加，而鹽敏感品種中兩者變化不明顯。Sawahel和Hassan（2002）研究表明，轉(zhuǎn)VaP5CS基因的小麥株系耐鹽性遠高于對照。Han和Hwang（2003）研究表明，轉(zhuǎn)PvP5CS1基因擬南芥植株可忍耐150 mmol/L NaCl鹽脅迫，死亡率明顯低于對照。李志亮等（2005）、Xu等（2006）研究表明，以豇豆的P5CS-F129A基因轉(zhuǎn)化高羊茅或麥草，轉(zhuǎn)基因植株耐旱性明顯提高。Yamchi等（2007）將擬南芥P5CS1基因（AtP5CS1）轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草耐滲透脅迫能力明顯增強。Karthikeyan等（2011）研究表明，水稻轉(zhuǎn)入烏頭葉豇豆P5CS1基因，轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽性明顯提高。徐博等（2015）將朝鮮堿茅（Puccinellia chinam poensis）的PuP5CS基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性。【本研究切入點】羽衣甘藍（Brassica oleracea var. acephala f. tricolor）屬十字花科蕓苔屬的變種植物，草本，1～2年生，常作為城市觀賞植物。但由于環(huán)境污染，土壤鹽堿化，培育耐鹽性強的羽衣甘藍已成為當(dāng)前育種的一項重要工作，而目前有關(guān)通過轉(zhuǎn)入AtP5CS1基因增強羽衣甘藍耐鹽性的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將AtP5CS1基因?qū)胗鹨赂仕{基因組中，測定轉(zhuǎn)基因植株的干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、葉片含水量及根系生長狀況并測定脯氨酸的含量及存活率，研究轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍的耐鹽性，為獲得較強的耐鹽性羽衣甘藍品種及其抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以羽衣甘藍名古屋為受體材料，大腸桿菌DH5α為受體細(xì)菌（通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)），菌種為LBA4404，表達載體pCAMBIA1301。質(zhì)粒pMDT-P5CS帶有AtP5CS1基因（NCBI登錄號NM_129539）由黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實驗中心保存提供；DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶分別購自TaKaRa公司；DNA凝膠提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1. 2 表達載體構(gòu)建

通過引物P1（5'-cggatccAAACTATGACGGAGAT

CG-3'），P2（5'-cgagctcTGGTACAAACCTCAAGGA-3'）從pMD-T-P5CS克隆基因P5CS，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；比對正確后分別用BamH I和Sac I酶切消化表達載體和克隆載體，然后將目的基因與表達載體進行回收且按3∶1的比例連接，選單克隆菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒后用凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌中。經(jīng)PCR鑒定，陽性菌于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 遺傳轉(zhuǎn)化

參照高航等（2015）的方法進行羽衣甘藍遺傳轉(zhuǎn)化。以無菌羽衣甘藍苗的下胚軸為轉(zhuǎn)化材料，接種到再生培養(yǎng)基中，經(jīng)過2 d預(yù)培養(yǎng)（16 h光/8 h暗），經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的下胚軸用農(nóng)桿菌浸染5 min，深度為0.5 OD；無菌吸水紙吸干后置于再生培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d，后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2周繼代1次，1個月后將幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；根長至3 cm左右煉苗移植。

1. 4 抗性植株的Southern blotting檢測

參照Murray和Thompson（1980）用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍和對照基因組DNA。以P1和P2為引物，轉(zhuǎn)基因和對照羽衣甘藍基因組DNA為模板，對其進行PCR擴增。羽衣甘藍基因組DNA用EcoR I內(nèi)切酶37 ℃酶解后，采取以地高辛隨機標(biāo)記AtP5CS1基因全長作為探針，化學(xué)發(fā)光信號的Southern blotting檢測參考相關(guān)手冊（DIG DNA Labeling and Detection Kit，Roche，德國）進行操作。

1. 5 抗性植株的qRT-PCR檢測

以4個T1代轉(zhuǎn)基因株系（Y1、Y2、Y3和Y4）及對照苗葉片為檢測材料，每個株系檢測3株苗。選擇羽衣甘藍的葉樣品用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取RNA。用紫外分光光度計在260/280 nm處測定RNA濃度。參照SMART cDNA synthesis Kit說明書合成cDNA第一鏈。qPCR在ABI 7300實時檢測系統(tǒng)進行檢測。使用試劑為Power Sybr Green PCR試劑（ABI）。actin基因（NCBI登錄號AF044573）為內(nèi)參基因。用AtP5CS1基因P3（AtP5CS1基因F：5'-GATACGGATATGGCAAAGC

G-3'），P4（AtP5CS1基因R：5'-CCAAGTCCAAATCGG

AAACC-3'）和P5（actin基因F：5'-GGAAGGACTTG

TACGGTAACATTG-3'），P6（actin基因R：5'-TGGACC

TGCCTCATCATACTCA-3'）熒光定量PCR引物。反應(yīng)體系參考Li等（2009）的研究結(jié)果。所有PCR進行3次重復(fù)，在同一條件下進行測試?；蚩截悢?shù)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法（Li et al.，2009）進行定量分析。

1. 6 轉(zhuǎn)基因植物耐鹽脅迫分析

用潮霉素浸泡T1代羽衣甘藍種子，對其進行篩選，選定30粒正常發(fā)芽、胚根統(tǒng)一且根長在2～3 mm的種子，當(dāng)根長至5 mm左右，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)培養(yǎng)盤中，MS培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d 后，用150 mmol/L NaCl處理，對照用同體積的營養(yǎng)液；培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)（溫度24 ℃，濕度80%，光照8000 lx，16 h光/8 h暗）。材料處理5 d后，刻度尺測量主根長、最長側(cè)根長；計數(shù)側(cè)根數(shù)；天平測定根干質(zhì)量/鮮質(zhì)量（DW/FW）、整株干質(zhì)量和鮮質(zhì)量。按照陳建勛和王曉峰（2006）的方法測定相對水含量、葉片脯氨酸含量和電導(dǎo)率。試驗結(jié)束后計算對照組與處理組存活率，存活率（%）=存活數(shù)量/總數(shù)量×100 。所有試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍的PCR擴增結(jié)果

選取8株經(jīng)潮霉素浸種獲得的轉(zhuǎn)基因植株幼苗進行PCR擴增，結(jié)果（圖1）顯示均呈陽性。

2. 2 轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍Southern blotting分析結(jié)果

從PCR檢測陽性的葉子中提取總DNA，使用潮霉素基因為雜交探針，總DNA用EcoR I進行酶解，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，對照植物無雜交條帶，而轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍出現(xiàn)雜交條帶，且大多數(shù)為單拷貝，少量呈多個拷貝。說明AtP5CS1基因已成功整合到羽衣甘藍的基因組中，有的插入1個序列，有的插入多個序列。

2. 3 轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍定量表達分析結(jié)果

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）以actin為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖3所示，AtP5CS1基因mRNA在Y1、Y2株系中的表達水平較高，在Y3、Y4株系中表達水平相對較低，對照中AtP5CS1基因的mRNA沒有表達。

2. 4 轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍耐鹽性分析結(jié)果

2. 4. 1 轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍在鹽脅迫下的生長性狀 由圖4可看出，用150 mmol/L NaCl脅迫處理后，對照植株的生長受到不同程度抑制，生長趨勢下降。AtP5CS1基因的mRNA表達量較高株系Y1、Y2的主根和最長側(cè)根長度較長，側(cè)根數(shù)目較多，整株干質(zhì)量和鮮質(zhì)量較重，與對照的差異均達顯著水平（P<0.05，下同）。說明AtP5CS1基因表達量與植株根的生長狀態(tài)呈正相關(guān)。

2. 4. 2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍生理特性及存活率 由圖5可看出，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍Y1、Y2株系的葉片相對水含量顯著高于對照，而葉片相對電導(dǎo)率顯著低于對照；脯氨酸含量及存活率均極顯著高于對照（P<0.01）。表型觀察（圖6）與數(shù)據(jù)分析一致，說明轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的耐鹽性。

3 討論

本研究成功獲得羽衣甘藍轉(zhuǎn)AtP5CS1基因的高效轉(zhuǎn)化株系，利用PCR分析轉(zhuǎn)化植株，并進一步通過Southern blotting進行雜交證實。前人類似的報道是將VaP5CS1基因轉(zhuǎn)入小麥植株等（Sawahel and Hassan，2002）；Kavi Kishor（1995）也在煙草中過表達P5CS1基因， 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的P5CS酶活性明顯提高。本研究中發(fā)現(xiàn)AtP5CS1基因mRNA表達量也達到較高水平。Armengaud等（2004）在研究蒺藜苜蓿時發(fā)現(xiàn)植物響應(yīng)高滲應(yīng)激性，通常與游離脯氨酸的積累呈正相關(guān)。Yamada等（2005）把AtP5CS1轉(zhuǎn)入到矮牽牛屬植物中，發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量明顯增加，是總氨基酸含量的1.5～2.6倍；而對照野生型矮牽牛屬植物在正常條件下的脯氨酸含量僅為總氨基酸含量的0.50%～

1.01%。Yamchi等（2007）觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，煙草中轉(zhuǎn)入AtP5CS1基因，轉(zhuǎn)基因煙草較非轉(zhuǎn)基因煙草植株的脯氨酸含量增加26倍。Kiran Kumar Ghanti等（2011）、Karthikeyan等（2011）觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，水稻轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因鷹嘴豆脯氨酸含量是對照的5倍。本研究結(jié)果表明，經(jīng)150 mmol/L NaCl處理5 d，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量均高于野生型對照，表明AtP5CS1基因的轉(zhuǎn)入能有效提高轉(zhuǎn)基因羽衣甘藍脯氨酸的積累，與上述前人研究結(jié)果基本一致。

陳吉寶等（2010）將菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1轉(zhuǎn)入擬南芥，在滲透脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株平均相對發(fā)芽率分別是野生型的1.60和1.62倍。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的脯氨酸含量分別是野生型的2.68倍，平均相對根長分別是野生型植株的1.20倍，顯著高于對照；而相對電導(dǎo)率是野生型植株的85%；顯著低于野生型。但本研究用于脅迫處理的NaCl濃度為150 mmol/L，未涉及更高的鹽濃度，且選用的株系為T1代轉(zhuǎn)基因植株，下一步應(yīng)對更高的鹽脅迫濃度及T2代純合體植株的耐鹽穩(wěn)定性進行深入研究。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)AtP5CS1基因植株的耐鹽表型優(yōu)于對照植株，即AtP5CS1基因在羽衣甘藍中的表達明顯改善了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

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（責(zé)任編輯 王 暉）