楊富溶 沈建華

摘 要：本研究制備了低分子肝素（LMWH）軟膏劑并建立了制劑質(zhì)量控制方法。按照不同處方和制備工藝制得軟膏劑基質(zhì)，通過(guò)軟膏劑綜合評(píng)分法對(duì)所制得基質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。將LMWH原料藥溶解，合并入基質(zhì)水相組分，按照所確定的軟膏劑最佳處方和最優(yōu)工藝，制備LMWH軟膏劑。用羊血漿法分別測(cè)定原料藥和制劑中LMWH的效價(jià)。結(jié)果表明，按照處方1制備工藝3所制得的軟膏劑基質(zhì)綜合評(píng)價(jià)得分最高。測(cè)得的軟膏劑中LMWH含量為147.03U/g，為標(biāo)示量的91.89%。因此，本研究中LMWH軟膏劑的制備方法可行，制劑質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單快速，適合少量制備LMWH外用劑型。

關(guān)鍵詞：低分子肝素；軟膏劑；效價(jià)；羊血漿法

低分子肝素（LMWH）是肝素經(jīng)降解得到的低分子量的肝素片段或經(jīng)分級(jí)法得到的低分子量肝素組分，仍為多糖類物質(zhì)，具有類似肝素的抗凝活性。研究表明，LMWH除了具有抗凝活性之外，還有諸如抗炎、抗過(guò)敏等其他藥理活性，可應(yīng)用于相關(guān)疾病的治療[1]。軟膏劑為外用劑型之一，涂敷后于病變部位釋藥治療疾病，避免了口服給藥的胃腸道破壞與肝首過(guò)效應(yīng)，可減少血藥濃度波動(dòng)，是克服藥物副作用的有效用藥途徑之一[2]。本研究擬制備LMWH軟膏劑，并探究制劑中LMWH效價(jià)的測(cè)定方法以進(jìn)行制劑質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

LMWH原料藥系實(shí)驗(yàn)室自制，LMWH標(biāo)準(zhǔn)品（效價(jià)60U/mg）從惠興生化試劑有限公司購(gòu)買，綿羊血漿（標(biāo)準(zhǔn)條件下血漿半凝固度劑量Vl/2為180μL）從東營(yíng)愛(ài)博科技助劑廠購(gòu)買，其他試劑為分析純。

JM-L型膠體磨（蘇州明冠膠體磨廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1軟膏劑基質(zhì)處方

軟膏劑基質(zhì)有油脂性、水溶性與乳劑型?；诖饲暗难芯浚狙芯窟x用乳劑型基質(zhì)[3]。

處方l：以100g為例，單硬脂酸甘油酯7g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油14g，水48g，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

處方2：以100g為例，單硬脂酸甘油酯6g，白凡士林11g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油14g，水48g ，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

處方3：以100g為例，單硬脂酸甘油酯5g，白凡士林10g，硬脂酸10g，液狀石蠟10g，甘油16g，水48g，十二烷基硫酸鈉1g，羥苯乙酯0.1g。

1.2.2軟膏劑基質(zhì)制備工藝

本研究所使用的軟膏劑基質(zhì)為O/W乳劑型基質(zhì)。乳劑型基質(zhì)中有3種組分，即水相、油相與乳化劑。制備時(shí)，可以兩相同時(shí)摻和，也可以將油相加入水相或?qū)⑺嗉尤胗拖?。乳化劑可以先加入水相或先加入油相，也可以水油兩相摻和后再后加?/p>

工藝1：油水分相法。

按1.2.1項(xiàng)下所列各處方，將單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液狀石蠟置于燒杯中，水浴加熱至熔化作為油相，保溫于85℃。取甘油加入蒸餾水中，加入十二烷基硫酸鈉以及羥苯乙酯加熱溶解作為水相，并保溫于85℃。在攪拌下將水相緩慢加入油相中，攪拌至冷凝即得[4]。

工藝2：后加乳化劑法。

按1.2.1項(xiàng)下所列各處方，將除十二烷基硫酸鈉以外的所有組分置于燒杯中，水浴加熱至熔化，保溫于85℃。另將乳化劑十二烷基硫酸鈉用少量蒸餾水溶解，并保溫于85℃，在攪拌下將該乳化劑水溶液加入上述基質(zhì)混合物中，攪拌至冷凝即得[4]。

工藝3：高剪切勻乳法。

按1.2.1項(xiàng)下所列各處方，將油相組分、水相組分分別置于燒杯中，水浴加熱，并保溫于85℃。將水相加入膠體磨中，再加入油相，持續(xù)攪拌5 min即得[4]。

1.2.3軟膏劑基質(zhì)處方及制備工藝評(píng)價(jià)

（l）離心后考察。分別離心各組軟膏劑基質(zhì)，轉(zhuǎn)速為4000 r/min，10 min后考察其是否出現(xiàn)粗粒。

（2）放置后考察。室溫下各組軟膏劑基質(zhì)放置7d，考察其外觀性狀。以外觀性狀及穩(wěn)定性作為考察指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法對(duì)不同處方及制備工藝制得的基質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)[5]。

1.2.4 LMWH原料藥效價(jià)測(cè)定

（l）標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備。稱取LMWH標(biāo)準(zhǔn)品（60U/mg）適量，用生理鹽水準(zhǔn)確稀釋至8U/mL，最為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（2）原料藥供試液制備。按原料藥估計(jì)效價(jià)（33U/mg），精確稱取約0.69LMWH原料藥置100 mL容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，充分混勻，作為儲(chǔ)備液。另精確吸取1.0mL至25mL容量瓶中，加生理鹽水至刻度，混勻，作為原料藥供試液[6]。

（3）效價(jià)測(cè)定。取冰凍血漿1瓶，融化，過(guò)濾。取14支試管，分為兩組，每組7支。一組加入1.2.4項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另一組加入1.2.4項(xiàng)下原料藥供試品溶液，以180μL為中點(diǎn)，5μL為級(jí)差，依次加入對(duì)應(yīng)體積的溶液，即165、170、175、180、185、190、195μL。向各管加入血漿1mL，再加入0.25%的氯化鈣溶液0.8mL。蓋好管塞，每管以同樣的方法倒轉(zhuǎn)3次，混勻內(nèi)容物，并使整個(gè)管內(nèi)壁潤(rùn)濕。將所有試管垂直放置于37℃水浴中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。1h后取出所有管，觀察并記錄血漿凝固程度，以血漿半凝固對(duì)應(yīng)的待測(cè)液體積為準(zhǔn)[6]。

分別測(cè)定準(zhǔn)品與原料藥的血漿半凝固度劑量SVl/2與TVI/2。原料藥的效價(jià)按照如下公式計(jì)算：

原料藥的效價(jià)= SVl/2/ TVI/2X8X25×lOO/mr

公式中：mr為所取原料藥的毫克數(shù)，效價(jià)的單位為U/mg。

1.2.5 LMWH軟膏劑的制備

根據(jù)1.2.4項(xiàng)所測(cè)得的原料藥效價(jià)值，按照軟膏劑中LMWH的標(biāo)示含量160U/g的要求，準(zhǔn)確稱取LMWH原料藥，用適量水溶解LMWH原料藥（該部分水量從基質(zhì)處方中扣除），將該藥液合并入基質(zhì)的水相中。按照1.2.3項(xiàng)軟膏劑基質(zhì)處方及制備工藝考察的結(jié)果，采用最佳處方與最優(yōu)工藝制備LMWH軟膏劑。

1.2.6軟膏劑中LMWH含量的測(cè)定

制劑中LMWH的效價(jià)測(cè)定是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。以軟膏劑中LMWH的標(biāo)示含量為準(zhǔn)，精密稱取LMWH軟膏劑約5g，置100 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇30mL，水浴加熱溶解后，加O.9%NaCI溶液定容，混勻，0～4℃放置過(guò)夜分層，棄上層油脂，取下層過(guò)濾，全部濾液轉(zhuǎn)移至置蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴加熱除乙醇至無(wú)乙醇嗅味，殘余溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，O.9%NaCI溶液定容，即得軟膏劑供試液[7]。測(cè)定軟膏劑供試液的血漿半凝固度劑量PVl/2，方法同1.2.4項(xiàng)。軟膏劑中LMWH的含量按照如下公式計(jì)算：

軟膏劑中LMWH的含量=SVI/2/PVl/2X8X100/mp

公式中：mp為所取軟膏劑的克數(shù)，含量的單位為u/g。

2結(jié)果與討論

2.1軟膏劑基質(zhì)處方與制備工藝評(píng)價(jià)結(jié)果

離心后發(fā)現(xiàn)，處方3的不同制備工藝所制得的基質(zhì)都出現(xiàn)粗粒；按照處方l與處方2制得的基質(zhì)離心后未出現(xiàn)粗粒，結(jié)果如表1所示。

所有基質(zhì)放置7d后，采用綜合評(píng)價(jià)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。處方中單硬脂酸甘油酯含量最高而白凡士林、甘油含量較低，即采用處方l時(shí)，所得軟膏外觀性狀最好，性質(zhì)穩(wěn)定，綜合評(píng)價(jià)得分高于處方2與處方3，因此處方1為最佳處方。采用處方l時(shí)，油水分相法制備的軟膏劑基質(zhì)在外觀性狀與穩(wěn)定性方面綜合評(píng)分最低，后加乳化劑法稍高，而高剪切勻乳法制備的軟膏劑基質(zhì)外觀性狀與穩(wěn)定性方面評(píng)分最高，因此確定處方1為最佳處方，工藝3為最優(yōu)工藝。

對(duì)軟膏劑基質(zhì)處方和制備工藝考察結(jié)果表明，處方中各組分的不同配比影響膏體的稠度，當(dāng)單硬脂酸甘油酯含量高，而甘油、白凡士林含量適中時(shí)，所得基質(zhì)稠度適中，不過(guò)度稠厚也不顯稀薄。而當(dāng)單硬脂酸甘油酯含量降低，甘油含量升高時(shí)，基質(zhì)稠度降低，稍稀；白凡士林含量升高時(shí)，基質(zhì)稠厚，涂展性差。在基質(zhì)制備工藝中，攪拌速度越快，剪切力越大，所制得的乳化體系越穩(wěn)定。因而，高剪切勻乳法所制得的基質(zhì)穩(wěn)定性最好，離心及久置不出現(xiàn)粗粒，也沒(méi)有油水分層現(xiàn)象。乳化劑的加入順序也會(huì)影響軟膏的性狀以及穩(wěn)定性。后加乳化劑法因油相與水相組分在乳化劑加入之前，已經(jīng)攪拌混合成分散體系，加乳化劑后因乳化作用進(jìn)一步分散，故其穩(wěn)定性稍好于油水分相法。

2.2 LMWH原料藥效價(jià)

經(jīng)測(cè)定，LMWH標(biāo)準(zhǔn)品的SVl/2為170μL，原料藥的TVI/2為190μL。計(jì)算得LMWH原料藥的效價(jià)為29.82U/mg。

2.3 LMWH軟膏劑的制備

按照所測(cè)得的LMWH原料藥的效價(jià)并結(jié)合軟膏劑中LMWH的標(biāo)示含量，精密稱取0.5366g原料藥，按照1.2.1項(xiàng)下處方l，用48mL水溶解，，加入甘油、十二烷基硫酸鈉及羥苯乙酯加熱溶解作為水相，保溫于85℃。另照1.2.1項(xiàng)下處方1將油相組分單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、液狀石蠟水浴加熱至熔化，保溫于85℃。按照1.2.2項(xiàng)下工藝3將水相加入膠體磨中高速攪拌，將油相加入上述水相中，攪拌5min即得LMWH軟膏劑。

LMWH作為生物活性物質(zhì)，其在制劑中的化學(xué)含量（原料藥質(zhì)量/制劑質(zhì)量）并不高。本研究中所制得的LMWH軟膏劑，其化學(xué)含量?jī)H為0.5366g/lOOg軟膏劑。正是因?yàn)槠湓谥苿┲械幕瘜W(xué)含量小，不到1%，其對(duì)于軟膏劑基質(zhì)的影響可以忽略。將本研究中所制得的LMWH軟膏劑進(jìn)行離心實(shí)驗(yàn)，未出現(xiàn)粗粒，所得制劑與軟膏劑基質(zhì)的綜合評(píng)分的結(jié)果一樣。

2.4軟膏劑中LMWH含量

經(jīng)測(cè)定，LMWH標(biāo)準(zhǔn)品的SVI/2為170μL，軟膏劑供試品的PVI/2為185μL。計(jì)算得軟膏劑中LMWH含量為147.03U/g，為標(biāo)示含量的91.89%。

LMWH為酸性多糖，結(jié)構(gòu)中含有硫酸基團(tuán)，可溶于水，作為具有一定分子量的生物分子，其發(fā)揮作用時(shí)要求保持特定的空間結(jié)構(gòu)，所以僅有LMWH的化學(xué)實(shí)體并不能保證其具有藥理活性，因而，該藥物的含量必須用效價(jià)（活性單位數(shù)∕制劑質(zhì)量）進(jìn)行標(biāo)示。LMWH以用天青A法進(jìn)行測(cè)定。該方法測(cè)得的為化學(xué)含量，其數(shù)值與LMWH的生物活性之間沒(méi)有良好的線性關(guān)系。如要使用該法，則每次測(cè)定需建立其與生物檢定法間符合線性關(guān)系的濃度范圍，步驟繁瑣，且結(jié)果會(huì)因每批LMWH的來(lái)源、生物活性差異而出現(xiàn)波動(dòng)。因此，中國(guó)藥典以及美國(guó)藥典都要求采用生物檢定法進(jìn)行檢定。中國(guó)藥典規(guī)定用兔血漿法，而美國(guó)藥典采用羊血漿法，本研究采用羊血漿法進(jìn)行測(cè)定。

用羊血漿法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，關(guān)鍵數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)際的血漿半凝固度劑量。本研究中所購(gòu)的羊血漿半凝固度劑量標(biāo)示為180μL（標(biāo)準(zhǔn)條件下），因此即以待測(cè)液體積180μL作為中位值，5μL為級(jí)差，分別測(cè)得SVI/2、TVI/2、 PVl/2，簡(jiǎn)單快速，縮短了效價(jià)測(cè)定的時(shí)間。

本研究中，LMWH軟膏劑的標(biāo)示含量為160U/g，而實(shí)際測(cè)得的含量為147.03U/g，為標(biāo)示含量的91.89%。原因可能是在制備軟膏劑供試品溶液的過(guò)程中造成了LMWH生物活性的部分損失。但測(cè)得值在標(biāo)示量的±10%以內(nèi)，仍然符合制劑中含量檢測(cè)的要求，可以作為制劑中藥物含量的檢測(cè)方法。當(dāng)然，制劑中含量測(cè)定還需要進(jìn)一步進(jìn)行精密度、回收率實(shí)驗(yàn)，確保含量檢測(cè)方法的系統(tǒng)適應(yīng)性。

3結(jié)語(yǔ)

總之，本研究所制備的LMWH軟膏劑符合制劑的要求，并且建立了簡(jiǎn)單快速測(cè)定原料藥LMWH效價(jià)與制劑中LMWH含量的方法，進(jìn)而能夠?qū)MWH軟膏劑進(jìn)行質(zhì)量控制，可供少量制備LMWH外用劑型參考。

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