吳林菁 馮華 吳紅梅 湯容容 王祥培

摘要： 酢漿草（Oxalis corniculata）為酢漿草科植物，資源分布廣泛，全草均可入藥。該研究為建立酢漿草超高效液相色譜指紋圖譜，采用乙腈-0.05%醋酸水溶液梯度洗脫，以Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色譜柱，流速0.3 mL·min1，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃等色譜條件，研究了15個(gè)不同產(chǎn)地30批酢漿草藥材的指紋圖譜。結(jié)果表明：確立了24個(gè)共有峰，相似度評價(jià)軟件計(jì)算30批樣品的相似度為0.839～0.987；應(yīng)用聚類分析對各樣品指紋圖譜的共有峰峰面積統(tǒng)計(jì)分析得出，除貴州劍河、貴州印江及貴州天柱8月3批樣品外，其余27批樣品共有化學(xué)成分的含量較為接近。該研究結(jié)果表明建立的酢漿草UPLC指紋圖譜方法簡便、迅速、可靠，較其HPLC指紋圖譜有更高的靈敏度和分辨率，極大地縮短了檢測時(shí)間，可用于酢漿草質(zhì)量評價(jià)的快速分析。

關(guān)鍵詞： 酢漿草， 超高效液相色譜， 指紋圖譜，聚類分析， 質(zhì)量評價(jià)

中圖分類號： Q946， R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號： 10003142（2017）09119509

Abstract： In order to establish fingerprint analysis by UPLC for the quality control of Oxalis corniculata， and to provide comprehensive evaluation of their quality in different regions， the fingerprint of O. corniculata was established by UPLC. The similarity evaluation and cluster analysis were used to deal with the experimental data， in order to find out the similarities and differences among the 30 batches of O. corniculata from 15 different areas. The specific chromatogram of O. corniculata was obtained， and 24 common peaks were identified. Similarities of the 30 batches of samples were 0.839-0.987. The results of cluster analysis were the 27 batches of samples content of chemical components were closer， in addition to samples of Jianhe County， Yinjiang County of Guizhou Province and Tianzhu County of Guizhou Province in August. The establishment of UPLC fingerprint of O. corniculata can provide a more comprehensive and faster reference for the quality control of Oxalis. This method is simple， rapid and reliable. It has higher sensitivity and resolution than HPLC and greatly shortens the detection time.

Key words： Oxalis corniculata， UPLC， fingerprint， cluster analysis， quality evaluation

酢漿草（Oxalis corniculata）廣布于世界各地，在我國主要分布于華北、華中、華南、貴州、云南和四川等地（國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，1999）。酢漿草主要含黃酮類、有機(jī)酸類、酯類等成分，全草均可入藥，具有清熱解毒、平肝定驚、消炎止痛等功效（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003；王海生等，2011；劉受先等，2011）。有文獻(xiàn)報(bào)道酢漿草具有保護(hù)肝損傷（陳應(yīng)康等，2015；Sreejth et al，2014）、降血脂（馬鴻軍等，2010）、抗焦慮（Sai et al，2011）及抗炎鎮(zhèn)痛（崔珺等，2015，2016）等藥理作用。由于我國是一個(gè)多地形、多氣候、生態(tài)環(huán)境差異較大的國家，尤其是西南地區(qū)，特殊的地理環(huán)境及氣候，對于資源分布廣泛的酢漿草的藥效是否會(huì)造成一定的影響，不同生境條件下的酢漿草質(zhì)量差異是否明顯，都是一個(gè)值得探討的問題。前期研究已發(fā)現(xiàn)鮮品酢漿草的橫切面顯微特征可作為鮮品酢漿草的顯微鑒別依據(jù)，但將其粉末顯微特征作為鑒別依據(jù)還值得商榷（吳林菁等，2013）。課題組已建立了10批貴州產(chǎn)酢漿草藥材及其混淆品的HPLC指紋圖譜（馮華等，2014）。但是，由于其分析時(shí)間過長、耗能高、分離效率較低，且樣品量較少，未能較為全面的表征分布廣泛的酢漿草藥材成分。因此，僅通過HPLC的指紋圖譜研究結(jié)果來判定藥材化學(xué)成分的整體性還不夠科學(xué)合理，還需借助更為快速、準(zhǔn)確的研究方法對酢漿草質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)（劉幼嫻等，2014；高青等，2016）。

超高效液相色譜指紋圖譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC），是一種以超細(xì)色譜柱填料為核心的新型色譜分離分析技術(shù)，相較于常規(guī)HPLC，UPLC具有更好的檢測分析效果（劉國雄等，2017；周新等，2008；曾慧婷等，2017）。因此，為了更為全面的表征酢漿草藥材成分，探索資源分布廣泛的酢漿草藥材專屬性的指紋圖譜特征，本研究建立了15個(gè)不同產(chǎn)地30批酢漿草藥材的UPLC指紋圖譜測定方法，為酢漿草的快速、準(zhǔn)確質(zhì)量評價(jià)提供參考依據(jù)，也為今后酢漿草的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AG135型電子天平（瑞士MettlerToledo公司）。甲醇為分析純（天津科密歐試劑公司），乙腈為色譜純（美國天地試劑公司），水為娃哈哈純凈水。酢漿草藥材主要采自貴州及其他省份，所有材料經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院王祥培教授鑒定確定為酢漿草科酢漿草（Oxalis corniculata）植物。具體產(chǎn)地見表1。

1.2 色譜條件

采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）色譜柱；以乙腈（A）-0.05%醋酸水溶液（B）為流動(dòng)相。梯度洗脫程序如下：0～2.5 min，95%～83% B；2.5～6 min，83%～78% B；6～8 min，78%～76% B；8～10 min，76%～74% B；10～13 min，74%～63% B；13～18 min，63%～29% B；18～21 min，29%～0% B。檢測波長為280 nm，柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL·min1，進(jìn)樣量為2 μL。

1.3 制備供試品溶液

精確稱取酢漿草粉末1 g（過6號篩），加入乙醇50 mL，超聲提取3次，第1、第2次每次提取30 min，第3次為20 min，濾過，取續(xù)濾液，合并，水浴蒸干，用乙醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?0 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即得供試品溶液。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度取產(chǎn)地為北京的酢漿草（S1號）供試品溶液，按 “1.2色譜條件”連續(xù)進(jìn)樣6次，以共有色譜峰（15號）為參比峰，分別計(jì)算共有色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積?？疾旖Y(jié)果：各共有峰的相對峰面積RSD及相對保留時(shí)間均<3%，符合指紋圖譜的要求，表明UPLC儀器精密度良好。

1.4.2 重復(fù)性取S8號（貴州都勻）藥材，制備供試品溶液6份，按 “1.2色譜條件”進(jìn)行測定，以共有色譜峰（15號）為參比峰，分別計(jì)算共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積?？疾旖Y(jié)果表明各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD均<2%，表明該方法重復(fù)性良好，適用于酢漿草UPLC指紋圖譜的分析。

1.4.3 穩(wěn)定性取S25號（貴州六枝）供試品，按照“1.2色譜條件”分別在0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣測定，以共有色譜峰（15號）為參比峰，分別計(jì)算共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積?？疾旖Y(jié)果顯示各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均<3%，說明符合指紋圖譜的要求。這表明所制備的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

取30批酢漿草供試樣品，按照“1.3”的方法制備供試樣品溶液，在“1.2”的色譜條件下分別進(jìn)行樣品檢測，并記錄UPLC色譜圖。將30批酢漿草藥材的UPLC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版）軟件中，參照S1號樣品的圖譜，設(shè)定時(shí)間漂移值為0.1，用中位數(shù)法自動(dòng)匹配譜峰，生成對照指紋圖譜。疊加圖譜及對照圖譜如圖1所示。在各批次樣品的圖譜中，選擇峰位相對居中，峰面積較大，且所有樣品共有的15號色譜峰為參比峰，以其保留時(shí)間為1，標(biāo)定了24個(gè)共有指紋峰，并對各共有色譜指紋峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果RSD值均<3.0%，符合指紋圖譜的分析要求。如表2、表3所示。

2.2 相似度評價(jià)

設(shè)定對照圖譜相似度為1，計(jì)算得出各樣品UPLC圖譜的相似度（表1）。 15個(gè)產(chǎn)地30批酢漿草樣品的相似度為0.839～0.987，表明本研究各批次酢漿草樣品的質(zhì)量相對穩(wěn)定，疊加UPLC特征圖譜（圖1）表明：不同產(chǎn)地的酢漿草化學(xué)成分基本一致，但在量上各成分卻存在一定差異。根據(jù)相似度計(jì)算結(jié)果得出，樣品 S30（產(chǎn)地貴州印江）相似度較低，其余14個(gè)產(chǎn)地29批樣品相似度則較高（相似度>0.9）。

2.3 聚類分析

聚類分析是一種探索性的數(shù)據(jù)分析手段，目前已廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、質(zhì)量評價(jià)和品種分類等方面的統(tǒng)計(jì)分析（徐鋒等，2013）。

指紋圖譜的共有色譜峰代表的是不同樣品所含有的相同化學(xué)成分，其峰面積即為共有化學(xué)成分的含量。本研究采用聚類分析的組間連接法，樣品間距離的計(jì)算方法為余弦距離，以各樣品共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS20.0軟件對15個(gè)不同產(chǎn)地、不同海拔的30批酢漿草樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，比較不同產(chǎn)地共有化學(xué)成分的含量是否存在差異。聚類結(jié)果見圖2。

當(dāng)判別條件距離為20時(shí)，系統(tǒng)將30批酢漿草樣品分為兩類，S2、S5、S30三批樣品被歸為一類，其余27批樣品聚為一類。其中，S2（產(chǎn)地貴州天柱）、S5（產(chǎn)地貴州劍河）、S30（產(chǎn)地貴州印江）的相似度依次為0.901、0.964、0.839， S2與S30較為接近且均較低，而S5的相似度較高。從采收時(shí)間看，S2與其同產(chǎn)地（貴州天柱）10月采收的樣品S3并未歸在同一類，從采收地點(diǎn)看S5與其同產(chǎn)地（貴州劍河）樣品S4、S6也未歸在同一類。綜上結(jié)果表明，貴州天柱產(chǎn)酢漿草受其采收時(shí)間的影響，其共有化學(xué)成分的含量會(huì)產(chǎn)生一定波動(dòng)；而貴州劍河產(chǎn)酢漿草的共有化學(xué)成分含量與其產(chǎn)地未呈現(xiàn)一定規(guī)律性；該文中其他產(chǎn)地樣品共有化學(xué)成分具有很好的相似性，且含量較為接近。

3討論與結(jié)論

3.1 提取方法的考察

本研究首先考察了供試品的制備方法，分別對甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇四種提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果以乙醇提取的樣品溶液圖譜出峰信息量較大，且基線較為平穩(wěn)。其次考察了回流和超聲提取兩種提取方式，結(jié)果兩種提取方式的UPLC色譜圖差異不明顯，但考慮回流提取較為繁瑣，耗時(shí)較長，最終確定超聲方法進(jìn)行提取；同時(shí)還考察了超聲提取30 min（超聲1次）、80 min（超聲3次，第1、第2次每次為30 min，第3次20 min）、120 min（超聲4次，每次30 min）三個(gè)提取提取時(shí)間，結(jié)果以超聲提取80 min（超聲3次，第1、第2次每次為30 min，第3次20 min）的圖譜信息量較豐富、提取較完全。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%醋酸三種流動(dòng)相體系，結(jié)果以乙腈-0.05%醋酸體系的色譜峰較多，且峰形和分離度效果都較好。比較了兩種超高效液相色譜柱Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）和Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）的色譜圖，結(jié)果顯示Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色譜柱的分離度和峰形效果較好，圖譜基線較平穩(wěn)?？疾熘鶞胤謩e為20、25、30、35 ℃時(shí)對色譜峰分離度的影響，結(jié)果在柱溫25 ℃時(shí)分離度效果較好。比較流速0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 mL·min1對色譜圖峰形的影響，結(jié)果以流速0.3 mL·min1的色譜圖峰形對稱。對210、230、254、280、310、360 nm不同波長進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在280 nm下圖譜的信息較為全面，各色譜峰響應(yīng)值較高，基線較為平穩(wěn)，故選擇280 nm作為檢測波長。

3.3 酢漿草指紋圖譜評價(jià)

影響藥材質(zhì)量的因素主要包括生態(tài)環(huán)境、采集時(shí)間、生長年限、加工方法和藥用部位的選擇以及指標(biāo)性成分或有效成分的含量、貯藏、包裝、運(yùn)輸?shù)?。由于生態(tài)環(huán)境和采收時(shí)期等的變化，其化學(xué)成分常處于一種動(dòng)態(tài)變化中，所以藥材質(zhì)量的影響因素和復(fù)雜性增加。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道不同產(chǎn)地酢漿草的刺槐素6CβD葡萄糖苷含量差異較大（劉受先等，2011），但僅以單一化學(xué)成分尚不足以說明化學(xué)成分復(fù)雜的酢漿草的內(nèi)部品質(zhì)，同時(shí)所測定的酢漿草藥材的產(chǎn)地應(yīng)更為廣泛和具體，以利于為綜合評價(jià)資源分布廣泛的酢漿草質(zhì)量提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)。本研究首次建立了酢漿草UPLC指紋圖譜，與HPLC指紋圖譜相比較，UPLC的分析時(shí)間明顯縮短，流動(dòng)相的消耗減少，而且靈敏度高、分離效率好。相似度評價(jià)分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地、不同海拔的酢漿草指紋圖譜相似度除貴州印江產(chǎn)的樣品S30為0.839，其余29批產(chǎn)地均在0.900以上，說明除貴州印江產(chǎn)地外，其余14個(gè)產(chǎn)地間的化學(xué)成分具有很好的相似性。共有峰峰面積的聚類分析結(jié)果表明，15個(gè)不同產(chǎn)地、不同海拔酢漿草藥材共有化學(xué)成分的含量不具有一定的生態(tài)環(huán)境及海拔規(guī)律性，并初步說明酢漿草生長適應(yīng)能力較強(qiáng)，其化學(xué)成分受地域環(huán)境差異的影響較小，但為保證酢漿草藥材質(zhì)量，必須規(guī)范其適宜產(chǎn)地及采收期，關(guān)于酢漿草藥材質(zhì)量與其生態(tài)環(huán)境及采收時(shí)間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究論證。本研究為全面評價(jià)酢漿草藥材質(zhì)量提供了更為高效、快速、靈敏且節(jié)能環(huán)保的檢測方法。

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