左芳　韋婷　童東　張藝　陳小?！≡?/p>

[摘要] 研究發(fā)現(xiàn)五味甘露藥浴散加減方藥浴有良好的抗炎活性，可以明顯改善關(guān)節(jié)炎癥程度，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，推測其可能與調(diào)控滑膜細(xì)胞MAPK通路有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)通過建立佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠（AA）模型，進(jìn)一步探討其調(diào)控滑膜細(xì)胞MAPK通路的機(jī)制。采用酶聯(lián)免疫法測定給藥2周AA大鼠血清中TNFα的水平，免疫組化法測定給藥4周踝關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白激酶ERK1/2，p38的含量，采用熒光定量PCR（RTPCR）法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織中JNK1，ERK1，p38的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥2周，可明顯降低AA大鼠血清中TNFα的水平（P<0.05）；給藥4周，降低踝關(guān)節(jié)滑膜組織中p38，ERK1/2的蛋白表達(dá)（P<0.05或P<0.01），降低膝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1，p38，ERK1的基因表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。綜上可見，五味甘露藥浴散加減方有效治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與其降低血清中TNFα的水平和滑膜組織中p38，ERK1/2的表達(dá)以及JNK1，p38，ERK1的基因表達(dá)，調(diào)控MAPK通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 五味甘露藥浴散加減方； 佐劑型關(guān)節(jié)炎； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

Pharmacodynamic mechanism of modified Ganlu Yaoyu San intreatment of

rheumatoid arthritis based on MAPK signaling pathway

ZUO Fang， WEI Ting， TONG Dong， ZHANG Yi*， CHEN Xiaorui， ZENG Yong

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] According to the findings， modified Ganlu Yaoyu San has a good antiinflammatory activity， and can significantly alleviate the degree of arthritis. Its therapeutic effect for rheumatoid arthritis may be related to the regulation of MAPK pathway of synovial cells. In the study， the rat adjuvant arthritis（AA） model was established to further investigate the pharmacodynamic mechanism for regulating MAPK pathway of synovial cells. Enzymelinked immune assay was used to determine the serum TNFα level of AA rats administered with drug for two weeks， synovial tissue protein kinases ERK1/2 and p38 content were determined by immunohistochemistry， synovial tissue JNK1， ERK1， p38 gene（mRNA） expression were detected with fluorescence quantitative PCR（RTPCR） method. According to the results， after administration for two weeks， the levels of serum TNFα of AA rat was significantly decreased（P<0.05）. After administration for four weeks， the protein expressions of p38 and ERK1/2 in synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）， the gene expressions of JNK1， p38 and ERK1 in knee joint synovial tissue were reduced（P<0.05 or P<0.01）. In conclusion， modified Ganlu Yaoyu San can effectively treat rheumatoid arthritis. Its mechanism might be related to the reduction of TNFα levels in serum， protein expression of p38 and ERK1/2 in synovial tissue， and JNK1， p38 and ERK1 gene expressions， and regulation of MAPK pathway.

[Key words] modified Ganlu Yaoyu San； adjuvant arthritis； TNFα； ERK1/2； JNK1； p38MAPK

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因未明的慢性破壞性關(guān)節(jié)病變疾病，屬于全身性自身免疫性疾病，以對稱性、進(jìn)展性、多關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[12]。藏藥浴療法是藏醫(yī)治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用手段[3]。五味甘露方是藏藥浴的基礎(chǔ)配方，最早記載于藏醫(yī)經(jīng)典巨著《四部醫(yī)典》[4]。臨床應(yīng)用最多的是五味甘露藥浴散加減方。研究表明五味甘露顆粒能抑制各種炎癥模型所致炎癥[5]，尤其對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效顯著。韋婷等[67]通過建立大鼠AA模型，研究五味甘露藥浴散加減方的抗炎活性，結(jié)果表明其能有效減小AA大鼠致炎側(cè)足跖腫脹度，改善致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜病理改變，提示五味甘露藥浴散加減方藥浴有良好的抗炎活性，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常引發(fā)的滑膜、關(guān)節(jié)等全身結(jié)締組織的破壞和解聚是RA主要的病理基礎(chǔ)，滑膜細(xì)胞的信號通路異常轉(zhuǎn)導(dǎo)是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[810]?；ぜ?xì)胞的過度異常增生、凋亡受阻和炎癥細(xì)胞的激活、浸潤是導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥持續(xù)存在的原因，絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的各種信號蛋白激酶都不同程度的參與了以上病理過程[1112]。故本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上擬通過建立AA模型，基于MAPK通路進(jìn)一步探討五味甘露藥浴散加減方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥效機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠（SPF級），體重（200±20） g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）201324。

1.2 藥品與試劑 受試藥物：五味甘露藥浴散加減方由西藏藏醫(yī)學(xué)院制備，外觀為棕褐色固體粉末，有刺鼻香味。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定為五味甘露藥材。方藥組成：刺柏葉Folium Junipfri 500 g，水柏葉Myricaria pulcherrima 500 g，麻黃Ephedrae Herba 500 g，大籽蒿Artemisia sieversiana 500 g，青稞Hordeum vulgare Linn 100 g，峨?yún)nthriscus sylvesteis 10 g，喜馬拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica Edgew.Heim 10 g，蒺藜Tribulus terrestris 10 g，黃精Polygonati Rhizoma 10 g，乳香Olibanum 10 g，天冬Asparagus cochinchinensis 10 g，決明子Cassiae Semen 10 g，黃葵子Belmoschus manihot L.Medic 10 g，堿花Saponaria officinalis 10 g，甘松Nardostachys chinensis Batal 10 g，巖精Bragzhun 10 g，寒水石Gypsum Rubrrum 10 g，黃硫磺Sulfur 10 g。功能發(fā)汗解表，消炎，平黃水，舒筋通絡(luò)，活血止痛。臨床上常用0.04 g·mL-1藥液浸泡全身或組織。藥液制備：將五味甘露藥各取等份同時(shí)放入容器中，注入開水，浸泡1夜后，拌勻，加熱、煮沸，至水分全部吸入藥材中。發(fā)酵藥物冷卻至與皮膚溫度相近時(shí)加入酵母或酒糟，重新裝入容器內(nèi)并密封，置20 ℃左右的室內(nèi)發(fā)酵3 d后，聞之，既有酒味，又有酸味和藥味時(shí)即可。發(fā)酵好的藥材中加入適量水，放置1 d，提取出藥液，如此連續(xù)操作3次，至第3天把3份提取液混合即可。

醋酸地塞米松（國藥準(zhǔn)字H33020822，批號130123，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格0.75 mg/片）；完全弗氏佐劑（Freund′s adjuvant complete，Sigma公司，批號#SLBF 9338V，規(guī)格1 g·L-1滅活結(jié)核桿菌）；卡介苗凍干粉（上海瑞楚生物科技有限公司，批號201409，規(guī)格60 mg/支）。TNFα ELISA試劑盒（批號YAD2015090302，北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）。

JNK1抗體，兔多克隆抗體，批號ab199380（德國默克集團(tuán)密理博中國有限公司）；p38MAPK抗體，兔多克隆抗體，批號ab197348（德國默克集團(tuán)密理博中國有限公司）；ERK1/2抗體，兔多克隆抗體，批號ab184699[英國abcam艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L），批號13152A11；三抗：辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素（HRP/AV），批號13152A11；山羊血清，批號13152A11；顯色劑：濃縮型DAB試劑盒，批號K135925C，均由北京中衫金橋生物有限公司提供。

Trizol（Ambion公司，貨號15596026）；SYBR Green PCR試劑盒（TAKARA公司，貨號RR420Q）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司，貨號639505）；RNaseⅠ（Fermentas公司，貨號AM2295）。PCR引物由南京金斯瑞合成。

1.3 儀器 2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)[德國徠卡（Leica）儀器有限公司]；ImagePro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數(shù)儀（美國Thermo公司）； Motic Images Advanced圖像分析軟件；T100Thermal Cycler PCR儀（BIORAD）；熒光定量PCR儀（RealTime System，BIORAD）；水平電泳設(shè)備DYC31D（BIORAD）；凝膠成像系統(tǒng)Universal Hood II（BIORAD）。

2 方法

2.1 AA大鼠模型的建立及給藥 SD健康大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，其余50只于大鼠右后足跖皮內(nèi)每只每次注射0.1 mL弗氏完全佐劑致炎，正常組在右側(cè)后肢足跖皮下注射0.1 mL生理鹽水，用足趾容積測量儀測量致炎前大鼠右后足足容積（mL）2次，取其平均值作為致炎前正常足容積作為基礎(chǔ)值。16 d后大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀出現(xiàn)，成功誘發(fā)AA大鼠模型。將AA大鼠隨機(jī)分為模型組、地塞米松組、五味甘露藥浴散加減方高劑量組（104.00 g·L-1） 、中劑量組（52.00 g·L-1） 、低劑量組（26.00 g·L-1）。

五味甘露藥浴散加減方高、中、低劑量組每天藥浴，將大鼠固定在大鼠固定器內(nèi)，用橡皮筋將固定器固定在底部直徑約32 cm，高為21 cm左右的木桶內(nèi)壁上，使大鼠后肢浸泡在2 L的藥液中[高劑量組（104.00 g·L-1）、中劑量組（52.00 g·L-1）、低劑量組（26.00 g·L-1）]，將木桶放在直徑約60 cm裝有水的大水盆里，電熱棒加熱大水盆里的水使木桶中水溫控制在（40±1） ℃，每天藥浴1次，每次30 min。模型組和對照組每天同體積溫水浴，條件同藥浴組，地塞米松組每天（0.150 mg·kg-1）灌胃1次，連續(xù)給藥4周。

2.2 AA大鼠血清中炎性細(xì)胞因子的測定 給藥第14天，大鼠后眼眶靜脈取血1.5 mL，靜置10～20 min，

于3 000 r·min-1下離心10 min，分離血清，采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，測定大鼠血清中細(xì)胞因子TNFα的含量。

2.3 AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ERK1/2，p38表達(dá)的測定 免疫組化法測定大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ERK1/2，p38的表達(dá)，給藥4周，大鼠麻醉取血處死，剪下致炎側(cè)足踝關(guān)節(jié)，用10%甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片，采用SP免疫組化法，一抗稀釋比為1∶200，顯色后中性樹膠封片。切片染色后，陽性表達(dá)顏色為淺黃色或棕黃色，表達(dá)主要集中在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或間質(zhì)等，陰性表達(dá)為藍(lán)色，底色為白色。

2.4 RTPCR法測定受試藥物對AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1，ERK1，p38基因表達(dá)的影響 給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，腹主動(dòng)脈取血處死固定，鈍性分離關(guān)節(jié)囊的纖維層和滑膜層，無菌剝離完整滑膜組織，稱量，放入1.5 mL EP管中，加入質(zhì)量10倍體積的RNAlater備用。cDNA鏈合成：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。取上述反轉(zhuǎn)后的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列包括：JNK1的上游引物5′TTTGGAGGAGCGAACT3′，下游引物5′GTCTGTATCCGAGGC3′；ERK1的上游引物5′GGGGTCTCCTCGTTCA3′，下游引物5′AGCCCTTCCATTCCA3′；p38的上游引物5′ CAGGGTAGTGGAGTGAT3′，下游引物5′CGTAAGGGACAGGAAT3′。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，所有指標(biāo)結(jié)果均以±s表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 給藥14 d大鼠血清中細(xì)胞因子TNFα的含量 與正常組比較，模型組大鼠血清中TNFα含量明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，地塞米松組大鼠血清中TNFα含量明顯降低（P<0.05）；五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠血清中TNFα含量明顯降低（P<0.05），見表1。

3.2 AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織ERK1/2，p38表達(dá)的測定 與正常組相比，模型組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯升高（P<0.01），與模型組相比，地塞米松組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯降低（P<0.01或P<0.05）；五味甘露藥浴散加減方中劑量組大鼠滑膜組p38，ERK1/2蛋白含量降低（P<0.05），五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠滑膜組織p38，ERK1/2蛋白含量明顯降低（P<0.01），見表2、圖1，2。

3.3 五味甘露藥浴散加減方對AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1，ERK1，p38基因表達(dá)的影響 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中JNK1，ERK1，p38基因mRNA表達(dá)量均較正常組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，地塞米松組和五味甘露藥浴散加減方高、中劑量組JNK1，p38表達(dá)量顯著降低（P<0.01），五味甘露藥浴散加減方低劑量組JNK1，p38表達(dá)量有降低趨勢（P<0.05），各給藥組ERK1表達(dá)量顯著降低（P<0.01），見圖3。

4 討論

RA是一種以全身多關(guān)節(jié)慢性滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的常見自身免疫性疾病。目前治療RA的藥物主要集中在非甾體抗炎藥、腎上腺糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但都普遍存在不良反應(yīng)較多，患者耐受性差等特點(diǎn)，且以緩解癥狀為主[13]。五味甘露藥浴療法是水浴療法和藥物療法的結(jié)合，采用藏區(qū)道地藥材制成藥液，將病體浸泡于溫?zé)崴幰褐邢丛?，利用水的溫?zé)嶙饔?，打開人體毛孔、疏通人體經(jīng)絡(luò)，使藥物的有效成分迅速透皮滲透吸收，直達(dá)病所，再通過發(fā)汗祛風(fēng)將病毒排出體外，從而達(dá)到祛病強(qiáng)身的目的。由于RA發(fā)病原因和機(jī)制仍未完全明確，無特效治療措施，所以構(gòu)建和應(yīng)用合適的RA動(dòng)物模型是篩選臨床治療RA藥物、考察其治療有效性和作用機(jī)制的研究基礎(chǔ)。目前比較常用的RA動(dòng)物模型主要有4種，其中AA模型的制備方法簡單，成功率較高，發(fā)病快，足跖腫脹明顯，有大量炎細(xì)胞浸潤，病理學(xué)改變與RA臨床表現(xiàn)相似，并結(jié)合課題組前期研究等各方面因素，考慮選擇使用AA大鼠模型。

細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)在RA的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，TNFα由活化的單核/巨噬細(xì)胞分泌，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長以及參與免疫調(diào)節(jié)，具有多種炎性和免疫反應(yīng)生物活性，是RA滑膜炎癥反應(yīng)中重要的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，幾乎所有RA炎癥環(huán)節(jié)都有它們的參與。兩者常同時(shí)分泌合成，相互影響，可促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤、滑膜組織和新血管增生，血管翳形成，引起骨和軟骨破壞，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛[1415]。TNFα可激活RA滑膜細(xì)胞分泌細(xì)胞黏附分子、膠原酶、環(huán)氧化酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、前列腺素E2（PGE2）等致炎因子，進(jìn)而促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的活化、破壞關(guān)節(jié)組織以及參與關(guān)節(jié)炎性破壞過程。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，AA大鼠在給予五味甘露藥浴散加減方14 d后，其血清中的TNFα較模型組明顯降低，五味甘露藥浴散加減方有較好的抗炎作用。

RA過程涉及多細(xì)胞間信號網(wǎng)絡(luò)通路的調(diào)控，促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPKs）是細(xì)胞漿內(nèi)一類高度保守的絲氨酸蛋白激酶，為細(xì)胞增殖和傳遞應(yīng)激信號的關(guān)鍵性蛋白激酶，在許多細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)中起著重要的中介作用。MAPK的主要功能是將炎癥刺激信息傳遞給細(xì)胞核，通過激活下游炎癥因子介導(dǎo)RA慢性炎癥及關(guān)節(jié)損傷，從而參與其發(fā)病機(jī)制。與RA病理狀態(tài)的維持及病情進(jìn)展密切相關(guān)的MAPKs有cjun氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK、p38MAPK 3種。其中JNK與基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生相關(guān)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解；p38MAPK通過微調(diào)抗炎及促炎信號影響炎性反應(yīng)。JNK通路是MAPK通路中重要通路之一，廣泛參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，能調(diào)節(jié)多種炎癥蛋白基因的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味甘露藥浴散加減方能夠明顯降低踝關(guān)節(jié)滑膜JNK1的蛋白表達(dá)和膝關(guān)節(jié)滑膜JNK1基因的表達(dá)。五味甘露藥浴散加減方可降低TNFα的水平，通過降低對JNK通路的刺激作用，下調(diào)MMP3的表達(dá)。這些炎癥因子促進(jìn)了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，五味甘露藥浴散加減方通過調(diào)控JNK通路、降低TNFα等炎癥因子的表達(dá)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生治療作用。此外，ERK通路的活化可促使T細(xì)胞增殖過度和多種細(xì)胞因子異常分泌增多，研究發(fā)現(xiàn)TNFα可通過ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制Ⅱ型膠原和連接蛋白的基因表達(dá)，進(jìn)而干擾關(guān)節(jié)軟骨合成和重建[17]，本實(shí)驗(yàn)中，五味甘露藥浴散加減方能夠降低踝關(guān)節(jié)滑膜的ERK1/2蛋白表達(dá)和膝關(guān)節(jié)滑膜ERK基因的表達(dá)。在RA滑膜組織T細(xì)胞和滑膜內(nèi)皮細(xì)胞上能檢測到磷酸化p38 MAPK，其能調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞黏附分子基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，五味甘露藥浴散加減方能夠降低踝關(guān)節(jié)滑膜p38蛋白表達(dá)和膝關(guān)節(jié)滑膜p38基因表達(dá)。五味甘露藥浴散加減方可降低TNFα的水平，降低RA滑膜細(xì)胞中p38顯著表達(dá)。通過p38 MAPK通路調(diào)控，降低滑膜細(xì)胞炎性因子的分泌和減弱關(guān)節(jié)組織的破壞。

綜上，MAPK信號通路參與了RA的炎癥反應(yīng)過程，JNK，ERK和p38途徑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中活化顯著增強(qiáng)。關(guān)節(jié)局部的炎癥及骨質(zhì)的破壞都與這3條通路的活化增強(qiáng)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給藥14 d后，五味甘露藥浴散加減方高劑量大鼠血清中TNFα的水平降低，給藥28 d后，滑膜組織中JNK1，ERK和p38的表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明五味甘露藥浴散加減方在控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎癥狀，緩解關(guān)節(jié)腫脹方面具有明顯療效，揭示其機(jī)制可能為通過抑制MAPK信號傳導(dǎo)通路，從而減少炎性因子的釋放，抑制滑膜異常增殖，達(dá)到阻抑類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕的目的。而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病十分復(fù)雜，涉及多條炎癥通路網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)涉及免疫、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)從其他途徑探討五味甘露藥浴散加減方治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，從而為今后的臨床工作提供更多科學(xué)理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]