馬劍龍,楊斌盛

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

表面活性劑SDS和CTAB誘導(dǎo)天青蛋白的解折疊研究

馬劍龍,楊斌盛*

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

天青蛋白;表面活性劑;穩(wěn)定性

0 引言

天青蛋白(Azurin簡稱Az)是由128個(gè)氨基酸殘基組成的I型銅金屬蛋白,在植物與細(xì)菌中充當(dāng)電子傳遞體[1],其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括一個(gè)α螺旋和八股β折疊,這些β折疊形成了一個(gè)“三明治”狀的疏水核心[2],唯一的色氨酸殘基(Trp48)位于這個(gè)疏水區(qū)。具有氧化還原特性的銅離子(Ⅱ)整合在Az中,成為CuⅡ-Az[3]。晶體結(jié)構(gòu)表明,銅離子(Ⅱ)的配位構(gòu)型為三角雙錐。其與處于三角平面的His117, His46以及Cys112結(jié)合較強(qiáng),與處于垂直方向的Gly45和Met121結(jié)合較弱[4]。CuⅡ-Az中銅的特殊的配位環(huán)境使得其在625 nm處有明顯的荷移吸收[3]。電子傳遞伴隨著銅離子(Ⅱ)的氧化還原以及色氨酸自由基的光誘導(dǎo)生成和淬滅[5]。作為一種模型蛋白,Az的解折疊過程被廣泛研究。有研究表明,Az有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。鹽酸胍誘導(dǎo)表明apo-Az解折疊為兩態(tài),結(jié)合銅離子(Ⅱ)后形成的CuⅡ-Az穩(wěn)定性增加,同時(shí)解折疊表現(xiàn)為三態(tài)[6]。

除了鹽酸胍之外,表面活性劑也經(jīng)常用于蛋白質(zhì)解折疊過程的研究。表面活性劑通常包括極性的頭部,和非極性的烷基鏈尾巴[7]。非離子型表面活性劑通常不能使蛋白質(zhì)變性,但是離子型表面活性劑在很低濃度的條件下(通常是毫摩爾)就能使蛋白變性。這表明表面活性劑與蛋白作用的方法與化學(xué)變性劑不同。通常認(rèn)為,解折疊的驅(qū)動(dòng)力是表面活性劑與變性的蛋白質(zhì)有更高的親和力[7]。

在本文中,我們用色氨酸殘基(Try48)的熒光和銅(Ⅱ)的吸收光譜作為內(nèi)源探針,用十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為變性劑,所得到的解折疊曲線用結(jié)構(gòu)基元模型處理[8]。研究了表面活性劑誘導(dǎo)Az的解折疊過程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

氯化鈉,冰乙酸,醋酸鈉,氰化鉀,氯化銅,鹽酸胍,丙烯酰胺(Acrylamide),碘化鉀(KI),硫代硫酸鈉,十二烷基硫酸鈉(SDS),十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)以及其他試劑均為分析純。

熒光光譜儀HORIBA scientific FluoroMax-4,紫外-可見分光光度計(jì)Varian Cary 50,MILLIPOPE 8010超濾裝置,AKTA primeTMplus蛋白純化系統(tǒng)。

1.2 蛋白的表達(dá)純化

以pGEX-6P-1為表達(dá)載體,通過基因工程得到pGEX-6P-1-Az重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。用20 μmol/L氯化銅以及0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)出可溶性蛋白,純化方法參照文獻(xiàn)[9]。通過AKTAprimeTMplus蛋白純化系統(tǒng)之后,所得到的蛋白樣品中仍有部分CuⅡ-Az和ZnⅡ-Az,之后用400 mmol/L氰化鉀浸泡該蛋白樣品4 h以除去金屬離子[3]。最終所得到的蛋白保存在50 mmol/L(pH 5.0) 的醋酸鈉緩沖液中。

1.3 方法

1.3.1 熒光光譜

在本文,所有蛋白樣品溶解在50 mmol/L,pH 5.0醋酸鈉緩沖液中,設(shè)定溫度為25℃。使用1.0 cm比色皿在HORIBA scientific FluoroMax-4熒光光譜儀上進(jìn)行測定。激發(fā)波長280 nm,掃描范圍290～500 nm,激發(fā)狹縫寬度為10 nm,發(fā)射狹縫寬度為10 nm。

1.3.2 紫外可見光譜

蛋白質(zhì)的紫外可見吸收在Varian Cary 50吸收光譜儀上測定,掃描范圍250～800 nm。

Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectra of Az in 50 mmol/L sodium acetate, pH 5.0(1)baseline；(2)apo-Az；(3)CuⅡ-Az圖1 Az的紫外可見吸收光譜(1)基線；(2) apo-Az；(3) CuⅡ-Az

2 結(jié)果與討論

2.1 apo-Az與CuⅡ-Az的紫外可見吸收光譜

圖1給出了apo-Az與CuⅡ-Az的紫外可見吸收光譜?？梢钥闯?apo-Az在280 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收,摩爾消光系數(shù)大約為9 000 mol/L-1·cm-1。CuⅡ-Az呈現(xiàn)明顯的亮藍(lán)色,紫外可見光譜測定表明其在625 nm附近有強(qiáng)烈的可見吸收,并且其吸光度約為280 nm處的42%。

2.2 Az在不同狀態(tài)下的熒光光譜

Az結(jié)構(gòu)包含有一個(gè)疏水核,唯一的色氨酸殘基(Trp48)就位于其中[2,10]。因此,Az在280 nm波長的紫外光照射下,會(huì)發(fā)出熒光。色氨酸殘基的熒光最大峰會(huì)隨著周圍環(huán)境極性的變化而發(fā)生移動(dòng),如圖2所示。

圖2給出了不同變性劑存在下,apo-Az在50 mmol/L (pH 5.0) 醋酸鈉緩沖液中的熒光發(fā)射光譜?？梢钥闯?蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰的形狀沒有太大的變化,只是最大發(fā)射波長發(fā)生了移動(dòng)。在沒有變性劑時(shí),apo-Az最大發(fā)射波長位于308 nm;在1.0 mmol/L SDS存在下,最大發(fā)射波長紅移至330 nm;在0.7 mmol/L CTAB存在下,最大發(fā)射波長紅移至344 nm;在5.0 mol/L GuHCl存在下,最大發(fā)射波長紅移至358 nm?？梢钥闯?5.0 mol/L GuHCl存在下,apo-Az中的色氨酸殘基(Trp48)完全處于極性的水相中。而在0.7 mmol/L CTAB或1.0 mmol/L SDS存在下,apo-Az中的色氨酸殘基(Trp48)處于部分親水的狀態(tài)[11]。

Fig.2 Fluorescence spectra of apo-Az in the presence of different denaturant in 50 mmol/L sodium acetate, pH 5.0(1) no denaturant,(2) 1.0 mmol/L SDS, (3) 0.7 mmol/L CTAB, and (4) 5.0 mol/L GuHCl圖2 不同變性劑存在下apo-Az在50 mmol/L (pH 5.0) 醋酸鈉緩沖液中的熒光光譜(1)沒有變性劑,(2) 1.0 mmol/L SDS,(3) 0.7 mmol/L CTAB,(4) 5.0 mol/L GuHCl

Fig.3 Fluorescence spectra of CuⅡ-Az in thepresence of different denaturant in 50 mmol/L sodium acetate,pH 5.0 (1) no denaturant, (2) 5.0 mmol/L CTAB,(3) 5.0 mmol/L SDS, and (4) 5.0 mol/L GuHCl圖3 不同變性劑存在下CuⅡ-Az在50 mmol/L (pH 5.0)醋酸鈉緩沖液中的熒光光譜(1)沒有變性劑,(2) 5.0 mmol/L CTAB,(3) 5.0 mmol/L SDS,(4) 5.0 mol/L GuHCl

圖3給出了CuⅡ-Az在不同溶液中的熒光發(fā)射光譜?？梢钥闯?與apo-Az相似,在沒有變性劑存在時(shí),CuⅡ-Az的最大發(fā)射波長位于308 nm;在5.0 mol/L GuHCl存在下,CuⅡ-Az的最大發(fā)射波長紅移至358 nm。然而,在5.0 mmol/L SDS或5.0 mmol/L CTAB存在下,CuⅡ-Az的最大發(fā)射波長仍舊位于308 nm,只是熒光峰的寬度增加,表明色氨酸殘基(Trp48)仍舊被包圍在疏水環(huán)境中。

2.3 Az的解折疊行為及穩(wěn)定性

Az的解折疊伴隨著色氨酸殘基(Trp48)從疏水環(huán)境到親水環(huán)境的變化,因此色氨酸殘基(Trp48)可以作為內(nèi)源熒光探針研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[12]。由圖2可知,apo-Az中加入SDS,使得其最大發(fā)射波長從308 nm紅移至330 nm。表明,SDS使得apo-Az由天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻庹郫B狀態(tài)。為了更好地描述蛋白質(zhì)的解折疊過程,本文用330和308 nm (I330 nm/I308 nm)的熒光強(qiáng)度的比值對(duì)SDS濃度并歸一化作圖,如圖4A變性曲線1所示?？梢钥闯?SDS誘導(dǎo)apo-Az的解折疊是典型的兩態(tài)過程,50%的蛋白質(zhì)由天然態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻庹郫B態(tài)時(shí)的變性劑(表面活性劑)濃度D1/2為0.46 mmol/L (SDS),蛋白質(zhì)對(duì)變性劑(表面活性劑)敏感程度的參數(shù)-m值為38.17 kJ/moL(mmol/L),并通過線性外推法得到解折疊的吉布斯能(ΔG)為17.39 kJ/mol[8]。所有的熱力學(xué)參數(shù)總結(jié)在表1中。圖3顯示,5.0 mmol/L SDS使得CuⅡ-Az的熒光峰形狀發(fā)生了變化。表明SDS同樣使CuⅡ-Az發(fā)生了解折疊。為了更好的比較apo-Az和CuⅡ-Az的穩(wěn)定性,SDS誘導(dǎo)CuⅡ-Az的變性曲線也展現(xiàn)在圖4A中的曲線2。顯然,CuⅡ-Az的解折疊呈現(xiàn)為三態(tài)過程,也就是存在一個(gè)中間態(tài)。基于結(jié)構(gòu)基元模型,這個(gè)三態(tài)曲線可由2個(gè)結(jié)構(gòu)基元解折疊曲線Y1和Y2的線性疊加而得到[8,13]。SDS誘導(dǎo)兩個(gè)結(jié)構(gòu)基元解折疊的D1/2分別為1.53和2.78 mmol/L,均大于SDS誘導(dǎo)apo-Az解折疊的D1/2(0.46 mmol/L),表明銅離子(Ⅱ)的結(jié)合使兩個(gè)結(jié)構(gòu)基元都變得更穩(wěn)定。兩個(gè)結(jié)構(gòu)基元解折疊的吉布斯自由能(ΔGi)分別為15.88和28.45 kJ/mol,其中ΔG1(15.88 kJ/mol),小于SDS誘導(dǎo)apo-Az解折疊的吉布斯自由能(17.39 kJ/mol),是因?yàn)橄啾扔赼po-Az,CuⅡ-Az對(duì)SDS的敏感程度降低,也就是其-m值減小了。相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)列在表1中。

Fig.4 SDS(A) and CTAB(B) induced unfolding of (1) apo-Az and (2) CuⅡ-Az. Y1 and Y2 are the unfolding curves of structural element 1 and structural element 2, respectively圖4 SDS (A) 和CTAB(B) 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)解折疊曲線(1) apo-Az, (2) CuⅡ-Az。Y1和Y2分別是擬合得到的結(jié)構(gòu)基元1與結(jié)構(gòu)基元2的解折疊曲線

在0.7 mmol/L CTAB存在下,apo-Az的最大熒光峰紅移至344 nm (圖2)。因此,用344 nm和308 nm (I344nm/I308nm)處熒光強(qiáng)度的比值來對(duì)CTAB濃度作圖,得到解折疊曲線,如圖4B曲線1所示?？梢钥闯?apo-Az的解折疊是兩態(tài)過程。解折疊的D1/2和吉布斯自由能(ΔG)分別為0.25 mmol/L和18.00 kJ/mol。同樣的,CTAB誘導(dǎo)的CuⅡ-Az的變性曲線也呈現(xiàn)為兩態(tài)過程 (圖4B曲線2)。但是D1/2明顯移動(dòng)到了更高的濃度(0.68 mmol/L),吉布斯自由能(ΔG)為24.79 kJ/mol。相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)也列在表1中。

表1 SDS和 CTAB 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)解折疊數(shù)據(jù)

高濃度的SDS不能使CuⅡ-Az的熒光峰發(fā)生移動(dòng),但會(huì)使CuⅡ-Az原本固有的藍(lán)色消失。圖5A為不同濃度SDS存在下,CuⅡ-Az在500～800 nm 的可見吸收光譜。可以看出,CuⅡ-Az在625 nm處有明顯的可見吸收,隨著SDS的加入,該吸收峰逐漸減小,并最終消失。表明SDS誘導(dǎo)的CuⅡ-Az構(gòu)象變化導(dǎo)致銅(Ⅱ)離子的配位環(huán)境被破壞,也就是說Az的結(jié)構(gòu)基元2 發(fā)生了解折疊。用625 nm處的可見吸收對(duì)SDS濃度作圖可得到其變性曲線,如圖5B曲線1所示?？梢钥闯?可見吸收光譜測定的CuⅡ-Az解折疊是兩態(tài)過程,而熒光光譜監(jiān)測到的SDS誘導(dǎo)CuⅡ-Az解折疊的過程呈現(xiàn)為三態(tài)(圖4A曲線2)。為了比較,將此三態(tài)過程也作在如圖5B中曲線2?？梢钥闯?結(jié)構(gòu)基元2的解折疊曲線Y2與曲線1的形狀相似,并且有相近的D1/2。表明紫外可見吸收光譜只能監(jiān)測到結(jié)構(gòu)基元2的解折疊。熒光光譜與紫外光譜監(jiān)測到的SDS誘導(dǎo)CuⅡ-Az結(jié)構(gòu)基元2解折疊曲線并不完全重合。

Fig.5 (A)Ultraviolet-visible specta of CuⅡ-Az in 50 mmol/L sodium acetate, pH,5.0 in different concentrations of SDS, (B) SDS-induced unfolding curves of CuⅡ-Az obtained by monitoring (1) the ultraviolet-visible spectra at 625 nm and (2) the fluorescence at 308 and 330 nm圖5 (A)CuⅡ-Az在不同濃度SDS中的紫外可見吸收光譜,(B)由監(jiān)測625 nm處的吸光度(1) 和330/308 nm熒光強(qiáng)度(2)得到的CuⅡ-Az的解折疊曲線

Az含有128個(gè)氨基酸殘基,其中酸性氨基酸殘基13個(gè),堿性氨基酸殘基17個(gè),疏水性氨基酸殘基55個(gè),唯一的色氨酸殘基位于疏水核中使蛋白質(zhì)的最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在308 nm處。按照結(jié)構(gòu)基元模型,Az由2個(gè)結(jié)構(gòu)基元組成,唯一的色氨酸殘基位于結(jié)構(gòu)基元1,銅結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)基元2。熒光光譜監(jiān)測的是位于疏水核中唯一色氨酸殘基隨變性劑SDS濃度變化其所處環(huán)境的變化,由于該蛋白含有大量的疏水性氨基酸殘基,蛋白整體對(duì)變性劑SDS是較敏感的,-m(kJ/(mol·mmol/L)為10.23?？梢娢展庾V監(jiān)測的是位于結(jié)構(gòu)基元2中銅結(jié)合位點(diǎn)配位環(huán)境的變化,只有能破壞銅配位環(huán)境時(shí)才有響應(yīng),即銅結(jié)合位點(diǎn)對(duì)變性劑SDS的敏感度較低,-m(kJ/(mol·mmol/L)為7.43。盡管CuⅡ-Az的銅結(jié)合位點(diǎn)對(duì)SDS的敏感度較低,但SDS的負(fù)電荷與五配位銅(Ⅱ)的靜電作用、與非極性疏水氨基酸殘基的疏水作用仍能破壞銅的配位環(huán)境。

即使在高濃度CTAB存在下,CuⅡ-Az的可見吸收光譜也沒有變化,表明CuⅡ-Az銅(Ⅱ)離子的配位環(huán)境沒有被破壞。CuⅡ-Az中的銅五配位環(huán)境呈正電性,有利于負(fù)電性基團(tuán)(如SDS)進(jìn)攻發(fā)生配體取代反應(yīng),而CTAB帶正電荷,單分子CTAB不可能與CuⅡ-Az中的五配位銅(Ⅱ)發(fā)生配位取代反應(yīng)。此外,SDS為十二烷基,在溶液中帶負(fù)電荷,CTAB為十六烷基,在溶液中帶正電荷。CTAB的臨界膠束濃度很低,大約為0.16 mmol[13],在臨界膠束濃度以下僅靠單分子與銅(Ⅱ)配位氨基酸殘基間的疏水作用不足以破壞銅的配位環(huán)境,高濃度時(shí)CTAB形成膠束更不可能與極性區(qū)的銅結(jié)合位點(diǎn)作用。因此,CTAB不能使結(jié)構(gòu)基元2發(fā)生解折疊。

2.4 SDS和CTAB誘導(dǎo)CuⅡ-Az解折疊態(tài)中色氨酸殘基(Trp48)與結(jié)合銅(Ⅱ)離子間的距離

作為電子傳遞體,由于銅(Ⅱ)離子與apo-Az的Cys等殘基配位,CuⅡ-Az是非常穩(wěn)定的,即使在高濃度化學(xué)變性劑(GuHCl)存在下,銅(Ⅱ)離子仍與apo-Az結(jié)合[2]。因此,本文用F?rster無輻射能量轉(zhuǎn)移估算SDS和CTAB誘導(dǎo)CuⅡ-Az解折疊態(tài)中色氨酸殘基(Trp48)與結(jié)合銅(Ⅱ)離子間的距離[14]。供體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移取決于供體的熒光發(fā)射光譜與受體紫外可見光譜的重疊積分,積分面積J可由公式(1)計(jì)算得到。

(1)

(1)式中,FD(ν) 為熒光供體在波數(shù)為ν的熒光強(qiáng)度;εA(ν) 為受體在波數(shù)為ν的摩爾消光系數(shù)。能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體之間的距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān)。

(2)

能量轉(zhuǎn)移效率E可由公式(3)計(jì)算得到。

(3)

F0和F分別表示apo-Az 和CuⅡ-Az的熒光強(qiáng)度。

R0是能量轉(zhuǎn)移效率為50%的臨界距離。

(4)

其中K2為偶極空間的取向因子,為2/3。n為介質(zhì)的折射指數(shù),取值 1.33[14]。色氨酸的熒光量子產(chǎn)率φD, 取值 0.097[15]。

Fig.6 (A) Spectral overlap between the absorption spectrum of CuⅡ-Az (1) and emission spectrum of apo-Az (2), (B)Emission spectra of apo-Az (1) and CuⅡ-Az(2)圖6 (A)CuⅡ-Az(1)的紫外可見吸收光譜和apo-Az(2)的熒光光譜,(B)apo-Az(1) 與CuⅡ-Az(2)的熒光光譜

在沒有表面活性劑 (SDS和CTAB) 存在時(shí),能量轉(zhuǎn)移供體(Trp48)的發(fā)射光譜與受體(結(jié)合銅(Ⅱ))的紫外可見吸收光譜的光譜重疊圖如圖6A所示,由式(1)計(jì)算得到重疊積分值為5.38×10-16cm3·mol·L-1。根據(jù)式(4)可以求得能量轉(zhuǎn)移效率為50%的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0為14.10 ?。相同狀態(tài)下apo-Az與CuⅡ-Az的熒光發(fā)射光譜如圖6B所示?？傻媚芰哭D(zhuǎn)移效率E為0.80。按照式(2)可計(jì)算出結(jié)合銅(Ⅱ)與色氨酸殘基(Trp48)之間的距離為11.19 ?,這一數(shù)值與晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)很接近(11.00 ?, 通過Pymol測量蛋白晶體1E5Y得到)。圖4的解折疊曲線表明,2.0 mmol/L SDS 或1.0 mmol/L CTAB 存在下,CuⅡ-Az處于不同的解折疊狀態(tài),因此,我們測定了這兩種表面活性劑存在時(shí)結(jié)合銅(Ⅱ)離子與色氨酸殘基(Trp48)之間的距離,相應(yīng)的參數(shù)列在表2中。

表2 不同表面活性劑存在下,CuⅡ-Az的一些參數(shù)

從表2中數(shù)據(jù)可知,天然態(tài)CuⅡ-Az中結(jié)合銅(Ⅱ)與色氨酸殘基(Trp48)之間的距離約為11 ?,能量轉(zhuǎn)移效率達(dá)80%;當(dāng)有表面活性劑SDS或CTAB存在時(shí),能量轉(zhuǎn)移效率顯著降低, CuⅡ-Az中結(jié)合銅(Ⅱ)與色氨酸殘基(Trp48)之間的距離增大,分別約為21? (2.0 mmol/L SDS中) 和16? (1.0 mmol/L CTAB)。表明表面活性劑的確引起了蛋白質(zhì)的解折疊,SDS誘導(dǎo)CuⅡ-Az解折疊的程度大于CTAB誘導(dǎo)CuⅡ-Az解折疊。

3 結(jié)論

致謝:本文所用Az基因由中國科技大學(xué)劉揚(yáng)中教授惠贈(zèng)

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Unfolding of Azurin Induced by SDS and CTAB

MA Jianlong,YANG Binsheng*

(Institute of Molecular Science, Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan, 030006,China)

azurin;surfactant;stability

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.021

2017-01-17；

2017-02-14

國家自然科學(xué)基金(21571117);教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)基金(20131401110011)

馬劍龍(1991-),男,山西晉城人,在讀碩士,從事無機(jī)化學(xué)方面研究,E-mail:1033095494@qq.com

*通信作者：楊斌盛(YANG Binsheng),E-mail:yangbs@sxu.edu.cn

O629

A

0253-2395(2017)02-0324-07