唐強,阮野,葉濤,朱路文,吳孝軍,李宏玉,田源

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頭穴叢刺聯(lián)合康復(fù)療法對局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血側(cè)皮層VEGF蛋白表達(dá)的影響

唐強1,阮野2,葉濤2,朱路文1,吳孝軍2,李宏玉2,田源2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150001)

目的 觀察針康法對局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損情況及缺血側(cè)大腦皮層血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的影響,探討針康法促進(jìn)大鼠受損功能恢復(fù)的作用機(jī)制。方法 選取健康雄性SD大鼠90只,隨機(jī)分為模型組、針刺組、康復(fù)組、針康組、假手術(shù)組5組,每組又分為3 d、7 d、14 d 3個亞組,每個亞組6只。采用改良的Zea-Longa線栓法制備右側(cè)大腦中動脈永久性梗死(MCAO)模型。針刺組大鼠行模擬頭穴叢刺法治療;康復(fù)組行跑臺訓(xùn)練;針康組行頭穴叢刺結(jié)合跑臺訓(xùn)練;模型組及假手術(shù)組不予以任何治療。采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)評定大鼠神經(jīng)功能缺損情況,并采用Western blot法測定缺血側(cè)大腦皮層VEGF蛋白表達(dá)量。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺損。與模型組相比,針刺組、康復(fù)組及針康組治療3 d后mNSSs比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05);治療7 d、14 d后,針刺組、康復(fù)組及針康組mNSSs評分比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組的mNSS評分均低于針刺組和康復(fù)組(＜0.05);針刺組和康復(fù)組mNSS評分比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。治療3 d后,各治療組大鼠VEGF蛋白表達(dá)量與模型組大鼠比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (＞0.05),7 d、14 d各治療組大鼠VEGF蛋白表達(dá)量較模型組大鼠明顯增多(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組VEGF表達(dá)量與針刺組、康復(fù)組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);康復(fù)組與針刺組大鼠各時間點VEGF表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。結(jié)論 頭穴叢刺法與康復(fù)訓(xùn)練均能夠改善局灶性腦梗死大鼠受損的神經(jīng)功能,并能夠提高大鼠缺血大腦皮層中VEGF蛋白表達(dá)量,且針康法聯(lián)合治療能夠取得更好的效果;其機(jī)制可能與VEGF的高表達(dá)能夠更好地促進(jìn)腦缺血區(qū)域血管的重塑與再生相關(guān)。

針刺療法;穴,百會;叢刺;康復(fù)訓(xùn)練;改良神經(jīng)功能缺損評分;血管內(nèi)皮生長因子;腦梗死

腦卒中歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”的范疇,又分為缺血性卒中和出血性卒中兩大類,其中缺血性卒中又稱腦梗死,是臨床中神經(jīng)系統(tǒng)方面的常見病、高發(fā)病,已經(jīng)成為現(xiàn)今人類三大致死疾病之一,并具有極高的致殘率,存活者多遺留有不同程度的運動功能障礙、語言障礙、智力障礙等神經(jīng)功能缺損情況,給家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。頭穴叢刺療法自上世紀(jì)70年代創(chuàng)立以來發(fā)展飛速,至今經(jīng)過多方研究證實已得到國內(nèi)外的普遍認(rèn)可,是臨床治療腦卒中的常用針刺方法;而現(xiàn)代康復(fù)治療技術(shù),以解剖學(xué)、運動學(xué)、生物力學(xué)等理論為基礎(chǔ),涵蓋物理治療、作業(yè)治療、言語治療等多方面訓(xùn)練方法,能夠最大限度地恢復(fù)患者喪失的運動及神經(jīng)功能,為患者更好地回歸家庭與社會起到了至關(guān)重要的作用。近些年,將頭穴叢刺與康復(fù)訓(xùn)練相結(jié)合已成為臨床針對腦梗死疾病的重要治療手段。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,其作用在于促進(jìn)血管內(nèi)皮增生、增強血管通透性和加速新生血管形成3個方面,對缺血損傷后的大腦起著至關(guān)重要的保護(hù)作用[1-3]。

本實驗采用改良的Zea-Longa線栓法制備永久性大腦中動脈梗死(MCAO)模型,應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score, mNSS)評定大鼠各時間點神經(jīng)功能恢復(fù)情況,并采用Western blot技術(shù)測定各組大鼠VEGF蛋白的表達(dá),探討針康法促進(jìn)腦梗死大鼠損傷功能恢復(fù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年清潔級雄性SD大鼠90只,體重(250±30)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)中心提供[合格證號SYXK(黑)2010007],隨機(jī)分為模型組、針刺組、康復(fù)組、針康組、假手術(shù)組5組,每組又分為3 d、7 d、14 d 3個亞組,每個亞組6只。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑(BZM、PMSF和PEP)、吐溫-20、過硫酸銨、b-巰基乙醇(2-ME)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚丙烯酰胺、TEMED、Tris、Glycine、PVDF、雜交膜、預(yù)染蛋白Marker (10-180kDa)、VEGF抗體、ACTIN抗體、二抗。

1.2.2 主要儀器

PB-10型PH計(Sartorius公司),PAC1000型電泳儀(Bio-RAD公司),AL204電子天平(Mettler-Toledo公司),轉(zhuǎn)膜槽(Bio-RAD公司),超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司),超低溫高速離心機(jī)(江蘇南京溫諾儀器設(shè)備有限公司),微量移液器(上海佳安分析儀器廠),華佗牌一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 動物模型制備

除假手術(shù)組外,其余各組均參照Zea-Longa線栓法[4]進(jìn)行改良,經(jīng)頸總動脈進(jìn)線制備右側(cè)MCAO模型。大鼠蘇醒后,以出現(xiàn)右側(cè)Horner征,提尾測試軀干左側(cè)卷曲,爬行時向患側(cè)轉(zhuǎn)圈為造模成功并可入組標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組同等條件抓取下造模方法同上,但僅分離暴露頸動脈,不對大腦中動脈進(jìn)行梗死。

1.4 處理方法

針刺組大鼠于造模成功24 h后,參照大鼠穴位圖譜[5],取大鼠百會穴及左右旁開2 mm,共3點,75%乙醇消毒后采用0.25 mm×13 mm毫針向鼻尖方向平刺入帽狀腱膜下5 mm,以模擬頭穴叢刺針法,每次捻轉(zhuǎn)2 min,速度200轉(zhuǎn)左右/min,留針30 min。每日1次。

康復(fù)組行跑臺訓(xùn)練,每次30 min,坡度0°,速度15 m/min。每日1次。

針康組行頭穴叢刺后將大鼠帶針置于跑臺上進(jìn)行訓(xùn)練,針刺及訓(xùn)練方法同針刺組和康復(fù)組。每日1次。

模型組與假手術(shù)組不予以任何治療。

1.5 改良神經(jīng)功能缺損評分(neurological severi- ty scores, NSS)

參考經(jīng)典NSS神經(jīng)功能缺損評分法[6]進(jìn)行改進(jìn),更改為14分評分表。

1.6 樣本取材處理

各組大鼠在各時間點嚴(yán)格按照無菌要求,深度麻醉后快速取腦,分離右側(cè)大腦皮層,置于液氮中保存。

1.7 Western blot測定VEGF蛋白的表達(dá)水平

從液氮中取出腦組織放入預(yù)冷研缽充分短時研磨,加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織,充分混勻后將懸液放入EP管中,使用前加蛋白酶抑制劑。將懸液放在冰上冰浴20 min,確保裂解充分,離心20 min后收集上清。采用BCA蛋白定量試劑盒定量檢測各標(biāo)本總蛋白。

將測定好濃度的細(xì)胞裂解液與4×sample buffer混勻,置于100℃沸水中5 min,低速離心3～5 s,室溫冷卻,將蛋白marker和樣品依次加到凝膠的上樣孔中,空余的上樣孔用1×sample buffer補齊。進(jìn)行SDS- PAGE電泳。預(yù)先將PVDF膜在甲醇中浸泡5～10 min,使之激活,采用濕法將凝膠轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)夾中,使膠位于陰極,PVDF膜位于陽極,緊密固定之后置于電專槽中,注入transfer buffer,在冰上以200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入雜交袋中,再加入3%的BSA- TBST封閉液,置于翻轉(zhuǎn)儀上平緩翻轉(zhuǎn),封閉2 h。將PVDF膜與抗體稀釋液置于雜交袋中孵育過夜。用TBST對PVDF膜進(jìn)行洗滌。將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗用3%的BSA-TBST封閉液稀釋,與PVDF膜置于雜交袋中,孵育1.5 h。用TBST對PVDF膜進(jìn)行洗滌。按照ECL增強發(fā)光液試劑盒的說明書配制曝光液,向PVDF膜上滴加顯色曝光。結(jié)果采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用-檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時間點VEGF蛋白陽性表達(dá)量比較

治療3 d后,各治療組大鼠VEGF蛋白表達(dá)量與模型組大鼠比較未見顯著差異(＞0.05),7 d、14 d各治療組大鼠VEGF蛋白表達(dá)量較模型組大鼠明顯增多(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組VEGF表達(dá)量與針刺組、康復(fù)組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);康復(fù)組與針刺組大鼠VEGF表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。詳見圖1、2,表1。

假手術(shù)組 模型組 康復(fù)組 針刺組 針康組 VEGF 3 dACTIN VEGF 7 dACTIN VEGF 14 dACTIN

圖2 各組大鼠VEGF表達(dá)灰度值分析

表1 各時間點各組大鼠VEGF表達(dá)灰度值分析

注 :與假手術(shù)組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與針刺組比較3)＜0.05;與康復(fù)組比較4)＜0.05

2.2 各組大鼠各時間點mNSS比較

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損發(fā)生。治療3 d后,各治療組mNSSs與模型組大鼠比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05);治療7 d、14 d后各治療組mNSSs與模型組大鼠比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。治療7 d、14 d后,針康組mNSS均顯著低于康復(fù)組與針刺組(＜0.05);康復(fù)組與針刺組大鼠mNSS比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。詳見表2。

表2 各時間點各組大鼠mNSS比較 (±s,分)

表2 各時間點各組大鼠mNSS比較 (±s,分)

組別n3 d7 d14 d 假手術(shù)組6000 模型組68.85±1.181)7.41±0.951)5.23±1.121) 針刺組68.71±1.211)6.37±1.051)2)4.15±1.071)2) 康復(fù)組68.69±1.081)6.35±1.071)2)4.11±1.011)2) 針康組68.65±1.171)5.13±1.271)2)3)4)2.27±1.051)2)3)4)

注 :與假手術(shù)組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05;與針刺組比較3)＜0.05;與康復(fù)組比較4)＜0.05

3 討論

神經(jīng)行為學(xué)評定是現(xiàn)代動物實驗針對神經(jīng)功能改變情況的直接記錄手段,是觀察腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損與恢復(fù)水平的一項重要指標(biāo)[7-8]。既往研究中,Seo HG等[9]曾對腦梗死大鼠采用抓握實驗和前肢放置實驗進(jìn)行評定,以觀察大鼠平衡協(xié)調(diào)能力的改善。Du Y等[10]也曾在電針治療腦梗死大鼠的實驗中,采用神經(jīng)行為學(xué)評分評定大鼠神經(jīng)功能的損傷情況,并得出結(jié)論,其治療機(jī)制可能與電針有加速缺血區(qū)血管再生的作用, 利用頭穴叢刺及康復(fù)訓(xùn)練對腦梗死大鼠進(jìn)行干預(yù),亦是對神經(jīng)功能損傷進(jìn)行的研究。與模型組相比,治療 7 d、14 d后,針刺組、康復(fù)組及針康組mNSSs評分均降低(＜0.05),表明頭穴叢刺療法、康復(fù)訓(xùn)練均可改善腦梗死大鼠受損的神經(jīng)功能。針康法作為二者的聯(lián)合治療手段,該組大鼠治療7 d、14 d后mNSS降低,較單一治療組更明顯(＜0.05),表明針康法能夠更好地改善缺血造成的神經(jīng)功能損傷。治療7 d、14 d后康復(fù)組mNSS與針刺組比較,無顯著性差異(＞0.05),表明對于神經(jīng)功能損傷的改善兩者并無明顯差異。

既往國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報道過VEGF與缺血性腦損傷的密切相關(guān)性[11-15]。它直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,是一種特異性很強的多功能因子,在缺血性腦損傷發(fā)生過程中能夠發(fā)揮調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化、新生血管形成和血管的通透性的作用[16]。由于中樞神經(jīng)元對缺氧刺激非常敏感,當(dāng)腦梗死發(fā)生后,缺氧環(huán)境就成為一種特異的激活信號,誘導(dǎo)VEGF應(yīng)激性表達(dá)增高,發(fā)揮相應(yīng)作用,提高腦組織缺血區(qū)的灌注及供氧,盡可能控制腦損傷發(fā)展[17]。對局灶性腦梗死動物的VEGF變化亦早有大量研究,觀察到梗死后7 d VEGF高表達(dá),同時血管增生活躍,證實了VEGF作為血管修復(fù)因子與腦缺血環(huán)境的相關(guān)性及其重要的腦血管保護(hù)意義[18-20]。而臨床對腦梗死患者血清VEGF變化規(guī)律的研究也證實,患者缺血發(fā)作后血清中VEGF呈動態(tài)增高表達(dá),初期腦血流量減少時VEGF表達(dá)迅速上調(diào),7 d內(nèi)上升趨勢明顯,而隨著腦血供改善其表達(dá)也逐漸減少, 7～14 d放緩,14 d后開始有回落趨勢,從而證實了VEGF在缺血發(fā)生后的腦組織血流灌注中發(fā)揮了重要作用[21-26]。在本實驗中,治療7 d、14 d后局灶性腦梗死模型組大鼠VEGF表達(dá)水平較假手術(shù)組大鼠明顯增加(＜0.05),提示VEGF通過生成血管提高了缺血側(cè)腦組織的血液灌注,與既往研究相符。經(jīng)頭穴叢刺療法、康復(fù)訓(xùn)練治療7 d、14 d后,VEGF表達(dá)較模型組增多(＜0.05),康復(fù)組與電針組比較,差異無顯著性(＞0.05),與mNSS結(jié)果相一致,表明頭穴叢刺與康復(fù)訓(xùn)練對缺血性腦損傷均具有一定的腦血管修復(fù)作用,且神經(jīng)功能缺損的改善與VEGF表達(dá)增多相關(guān)。治療7 d、14 d后,各組大鼠中針康組VEGF表達(dá)量最多 (＜0.05),提示頭穴叢刺聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練能夠令缺血側(cè)血管得到更好的修復(fù), mNSS也表明該組大鼠受損神經(jīng)功能恢復(fù)得最好,強調(diào)了這一結(jié)論。

本研究表明,針康法對局灶性腦梗死大鼠受損神經(jīng)功能的改善明顯優(yōu)于頭穴叢刺或康復(fù)訓(xùn)練的單一治療,這一結(jié)論與其能夠更好地促進(jìn)缺血側(cè)腦組織VEGF的表達(dá)密切相關(guān),同時也強調(diào)了這種相關(guān)性是其治療缺血性卒中的重要機(jī)制之一。本研究為探討針康法促進(jìn)腦梗死發(fā)作后神經(jīng)功能缺損改善提供了新的研究方向,證實了聯(lián)合治療優(yōu)勢的可靠性,為其更加廣泛地應(yīng)用于臨床提供了新的理論支持。但同時,本研究尚存在不足之處,治療介入的最優(yōu)時間、檢測時間點的密度等都有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Acupuncture plus Rehabilitation on Neurologic Deficit and VEGF Protein Expression in Cortex on the Infarction Side in Rats with Focal Cerebral Infarction

1,2,2,-1,-2,-2,2.

1.,150040,; 2.,150001,

Objective To observe the effect of acupuncture plus rehabilitation on neurologic deficit and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in cortex on the infarction side in rats with focal cerebral infarction, and to explore the action mechanism of acupuncture plus rehabilitation in promoting the recovery of impaired function in rats. Method Ninety healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a model group, an acupuncture group, a rehabilitation group, an acupuncture-rehabilitation group, and a sham operation group, and the five groups were further divided into three subgroups, i.e. 3 d, 7 d, and 14 d subgroups, 6 rats in each subgroup. The modified Zea-Longa method was adopted to prepare the model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) on the right side. Rats in the acupuncture group received simulant scalp-points cluster needling; the rehabilitation group was intervened by treadmill exercise; the acupuncture-rehabilitation group was intervened by scalp-points cluster needling plus treadmill exercise; the model group and sham operation group didn’t receive any interventions. The modified Neurological Severity Score (mNSS) was adopted to evaluate the rat’s neurologic deficit, and Western blotting was used to detect the expression of VEGF protein in cortex on the infarction side. Result Neurologic deficit wasn’t found in rats in the sham operation group. After 3-day treatment, the mNSSs in the acupuncture group, rehabilitation group, and acupuncture-rehabilitation group were insignificantly different from the score in the model group (＞0.05), while the differences were statistically significant respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the mNSS of the acupuncture-rehabilitation group was significantly lower than that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there was no significant difference in comparing the mNSS between the acupuncture group and rehabilitation group (＞0.05). After 3-day treatment, the expression of VEGF protein in each treatment group was insignificantly different from that in the model group (＞0.05), while the expression of VEGF protein in each treatment group was significantly higher than that in the model group respectively after 7-day and 14-day treatment (＜0.05). Respectively after 7-day and 14-day treatment, the expression of VEGF in the acupuncture-rehabilitation group was significantly different from that in the acupuncture group and rehabilitation group (＜0.05); there were no significant differences in comparing the expression of VEGF at each time point between the rehabilitation group and acupuncture group (＞0.05). Conclusion Scalp-points cluster needling and rehabilitation both can improve the neurologic function in rat models of focal cerebral infarction, and enhance the expression of VEGF protein in infarction cortex, and the integration of acupuncture and rehabilitation can achieve a better result; the action mechanism is possibly related to the high expression of VEGF which can better promote the reconstruction and regeneration of the vessels in cerebral infarction area.

Acupuncture therapy; Point, baihui (GV20); Cluster needling; Rehabilitation; Modified Neurological Severity Score; Vascular endothelial growth factor; Cerebral infarction

1005-0957(2017)05-0602-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0602

國家自然科學(xué)基金項目(81273818,81473762);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計劃(2012RCL02)

唐強(1963—),男,教授,博士,Email:tangqiang1963@163.com

2016-10-28