萬 瑩, 王 羽， 崔曉雪, 馮靜宜, 龍 杰, 劉永峰△, 趙 明

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞miRNA378和miRNA378*表達(dá)的影響*

萬 瑩1, 王 羽1， 崔曉雪1, 馮靜宜1, 龍 杰1, 劉永峰1△, 趙 明2△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)， 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院， 通遼 028000)

目的：研究柯薩奇B3病毒(CVB3)感染乳鼠心肌細(xì)胞miRNA378和miRNA378*表達(dá)的作用。方法：原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞分3組(n=6)：對照組(正常細(xì)胞)、CVB感染組(正常細(xì)胞+CVB3)、黃芪總黃酮組(正常細(xì)胞+CVB3+黃芪總黃酮)。CVB感染組感染CVB3，黃芪總黃酮組感染CVB3同時給予黃芪總黃酮20 mg/L。 采用免疫組化方法檢測乳鼠心室肌細(xì)胞α-SMA蛋白，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)。結(jié)果：①與對照組相比較，CVB感染組心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)明顯減少(P<0.01)；②與CVB感染組比較，黃芪總黃酮心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)明顯增加(P<0.01)。結(jié)論：黃芪總黃酮可以減少CVB3感染心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)。

柯薩奇B3病毒；黃芪總黃酮；乳鼠；miRNA378；miRNA378*

coxsackie virus B3; total flavonoids of astragalus; suckling mouse myocardium, miRNA378； miRNA378*

【DOI】 10.12047/j.cjap.5379.2017.013

病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是由病毒(主要由柯薩奇病毒引起，另有腺病毒、腸道病毒、EB病毒、人皰疹病毒、細(xì)小病毒B19和巨細(xì)胞病毒等)侵犯心臟引起的心肌實(shí)質(zhì)或間質(zhì)的局限性或彌漫性病變[1]，其中心肌組織嚴(yán)重而廣泛的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌收縮力急劇下降引起心力衰竭，是引起患者死亡的重要原因[2,3]。microRNAs (miRNAs)是一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA,通過與靶蛋白mRNA 3' 端非編碼區(qū)的不完全互補(bǔ)結(jié)合,抑制靶mRNA 轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。研究表明miRNA參與心肌發(fā)育、心肌肥大等病理過程[4]。miRNA-378和miRNA-378*的產(chǎn)物,叫正義鏈和反義鏈,microRNA前體有發(fā)卡結(jié)構(gòu) 在成熟過程中發(fā)卡結(jié)構(gòu)被

剪掉 形成miRNA-378和miRNA-378*，也叫左臂和右臂[6]。文獻(xiàn)報道：miRNA-378 和miRNA-378*調(diào)控心肌重塑與心力衰竭發(fā)生密切相關(guān)[5]。黃芪總黃酮(total flavonoids of Astragalus,TFA)是從蒙古黃芪中分離出的主要活性成分[7]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)TFA明顯改善柯薩奇B3病毒(coxsackievirus B3，CVB3)所致病毒性心肌炎小鼠心肌病理改變和超微結(jié)構(gòu)[8]，但作用機(jī)制尚未明確。本研究擬觀察TFA對CVB3感染乳鼠心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)影響，闡明TFA改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物藥品與儀器

1～3 d Balb/c新生乳鼠購置吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心,許可證號：scxk(吉)2011-0004； Hela細(xì)胞由內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke)公司, RNA simple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN)公司,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；：CVB3，Woodruf親心肌株由吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院提供。

1.2 柯薩奇B3病毒感染心肌細(xì)胞模型制備

1.2.1 病毒擴(kuò)增 人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng), 在對數(shù)生長期接種病毒,當(dāng)90% 的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)后, 收集病毒液, 重復(fù)3次, 病毒懸液分裝于-80℃保存。用Reed-Mnench法測定病毒滴度。

1.2.2 乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，用PBS反復(fù)清洗。將清洗后的心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。加入0.1%Ⅱ型膠原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化好后將其移入15 ml離心管1 500 r/min離心7 min去上清。用PBS重懸沉淀，用吸管反復(fù)吹打后1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后放置到培養(yǎng)板中。成纖維細(xì)胞貼壁較快，2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細(xì)胞，上清懸液中為較純的心肌細(xì)胞。細(xì)胞靜置培養(yǎng)24 h，隨后每2天換一次液。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%左右，PBS清洗2次。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞濃度為5×104cells/ml，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。24 h可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞密度一般在70%為宜。

1.2.3 免疫組織化學(xué)方法鑒定乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞 各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定：0.1%TritonX-100孵育；3%過氧化氫孵育；血清封閉；一抗孵育；二抗孵育；辣根酶標(biāo)記；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；鏡檢。

1.2.4 黃芪總黃酮對感染CVB3的乳鼠心肌細(xì)胞作用的觀察 乳鼠心肌細(xì)胞按照細(xì)胞濃度為5×104cells/ml接種于6孔板，并將其置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，心肌細(xì)胞隨機(jī)分成3組，每組3孔，取2組細(xì)胞與100 PFU的CVB3共同孵育1 h，棄上清后，其中一組加入正常培養(yǎng)液作為CVB感染組；另一組加入正常培養(yǎng)液，并加入黃芪總黃酮20 mg/L作為黃芪總黃酮組(劑量參照之前的驗(yàn)證)[8]；設(shè)立細(xì)胞對照組(僅加入培養(yǎng)液，不進(jìn)行病毒感染)，將3組心肌細(xì)胞在37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.3 Real time PCR 檢測各組心肌細(xì)胞miRNA378及miRNA378*表達(dá)

經(jīng)下列實(shí)驗(yàn)步驟：樣本總RNA提取;RNA濃度檢測;反轉(zhuǎn)錄;熒光定量PCR檢測。每種樣本每個基因進(jìn)行4個復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的選取，是舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)保留數(shù)據(jù)，利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)(表1)。

Tab. 1 CVB injured cardiomyocytes model preparation

OD260/OD280: Purity of DNA was assessed; CVB: Coxsackievirus B； AST: Astragalus

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞免疫組化

ɑ-SMA是心肌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，是心肌細(xì)胞可靠的標(biāo)志蛋白。為檢測分離的細(xì)胞為乳鼠心肌細(xì)胞，通過免疫組化檢測ɑ-SMA蛋白，各組均檢測出ɑ-SMA，確定3組細(xì)胞都是心肌細(xì)胞(圖1)。

Fig. 1 Immunocytochemistry of culturing myocardial cell (×200) A: Control group; B: Coxsackievirus B3 infecton group; C: Total flavonoids of astragalus group

2.2 real time PCR 檢測各組心肌細(xì)胞miRNA378和miRNA378*表達(dá)：

與對照組比較，柯薩奇病毒感染組心肌細(xì)胞miRNA378和miRNA378*表達(dá)明顯減少(P<0.01)。與CBV3感染組相比較，黃芪總黃酮心肌細(xì)胞miRNA378和miRNA378*表達(dá)明顯增加(P<0.01，表2)。

GroupmiRNA378miRNA378*Control1.00±0.021.00±0.03CVB0.76±0.01**0.56±0.02**AST0.94±0.01##0.78±0.02##

CVB： Coxsackievirus B; AST： Astragalus

**P<0.01vscontrol group;###P<0.01vsCVB group

3 討論

心臟重構(gòu)是心臟在對抗外界因素所致的壓力和阻力時為了維持穩(wěn)態(tài)而進(jìn)行自身調(diào)節(jié)的適應(yīng)性過程，如果所致壓力和阻力作用持續(xù)存在，這種過程可發(fā)展為不可逆作用，同時在細(xì)胞和細(xì)胞外水平可發(fā)生凋亡、壞死和纖維化等變化。本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡，并且黃芪總黃酮對病毒性心肌炎心力衰竭小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。文獻(xiàn)報道：miRNA-133、miRNA-1、miRNA-21、miRNA-208、miRNA-29等都參與心肌重構(gòu)，而且miRNA-146b直接參與病毒性心肌炎的病理學(xué)發(fā)病過程[4]。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA-378通過影響轉(zhuǎn)化因子β1(TGFβ-1)分泌而參與心肌纖維化過程[9]，抑制miRNA-378表達(dá)能誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化[10]，重度心力衰竭患者miRNA-378 和miRNA-378*表達(dá)顯著下降。隨著患者心功能好轉(zhuǎn)，miRNA-378 和miRNA-378*表達(dá)也明顯增加[11]。黃芪總黃酮通過干預(yù)病毒性心肌炎miRNA-378 和miRNA-378*表達(dá)來影響心肌重構(gòu)，進(jìn)而改善病毒性心肌炎導(dǎo)致的心臟功能下降。

本實(shí)驗(yàn)觀察到黃芪總黃酮通過干預(yù)病毒性心肌炎miRNA-378 和miRNA-378*表達(dá)來影響心肌重構(gòu)，進(jìn)而改善病毒性心肌炎導(dǎo)致的心臟功能下降。揭示了黃芪總黃酮對病毒性心肌炎作用產(chǎn)生機(jī)制，為傳統(tǒng)藥物走向現(xiàn)代化提供了理論基礎(chǔ)。而miRNA378及miRNA-378*表達(dá)是如何調(diào)控病毒性心肌炎所致心肌重構(gòu)還需在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。

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國家自然科學(xué)基金課題(81360587)

2015-11-16 【修回日期】2016-10-19

R331.3；R332

A

1000-6834(2017)01-055-03

△【通訊作者】Tel: 13474859991; E-mail: langzhe73@163.com, dr.liudanial@gmail.com