策力木格 聶穎蘭 梁 慧 張小峰 松 林* 圖 雅

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700；3.中國中醫(yī)科學(xué)院數(shù)據(jù)中心,北京 100700)

蒙藥草烏及其炮制品的六種生物堿類成分血漿中含量測定△

策力木格1聶穎蘭2梁 慧1張小峰1松 林1*圖 雅3

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700；3.中國中醫(yī)科學(xué)院數(shù)據(jù)中心,北京 100700)

目的：建立血漿中，草烏及其訶子湯炮制品的6種生物堿類成分LC-MS含量測定的方法。方法：血漿樣品用加25%氨水、乙醚萃取后，采用ZORbax-Extend-C18 4.6×250mm 5-Micron 80A柱子檢測，流動相水相為10mmol醋酸銨水溶液(氨水調(diào)ph=9.0)有機(jī)相為乙腈，選擇離子檢測m/z 604(苯甲酰烏頭原堿)、m/z 590(苯甲酰新烏頭原堿)、m/z 574(苯甲酰次烏頭原堿)m/z 632(新烏頭堿)、m/z 646(烏頭堿)、m/z 616(次烏頭堿)。結(jié)果：本方法6種成分線性關(guān)系均良好，精密度、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)RSD都低于10%，加樣回收率為59.11%～96.57%。結(jié)論：此樣品處理快速簡便、檢測方法精密度高，適用于血漿中新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿檢測，以其為草烏及訶子湯炮制草烏的進(jìn)一步藥代毒代動力學(xué)研究提供參考。

草烏；炮制；訶子制草烏；含量測定

草烏為毛茛科多年生草本植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根[1]。是中醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥。蒙醫(yī)主要用于殺“粘(nian)”，止痛，燥“協(xié)日烏素”。草烏含有生物堿、糖類、揮發(fā)性成分，但在這些成分中起主要治療作用的是烏頭類生物堿，并且草烏的有毒成分也恰恰是起主要治療作用的烏頭類生物堿[2]，主要有烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，而且其治療量和中毒量非常相近，安全范圍小[3]因服用含烏頭堿類毒性成分的藥而致中毒的事故每年都有大量發(fā)生。為了降低草烏的毒性有多種炮制方法被采用，草烏經(jīng)炮制后，毒性大大減低，可內(nèi)服入藥。草烏蒙醫(yī)特色炮制法，即訶子湯炮制草烏方法廣泛收到認(rèn)可。本研究通過檢測草烏生藥及其訶子湯炮制品口服給藥動物血漿中新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿及苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的含量，以其為草烏及訶子湯炮制草烏的進(jìn)一步藥代毒代動力學(xué)研究提供參考。

1 儀器與試劑

液-質(zhì)聯(lián)用儀 ：Agilent 1200高效液相色譜儀；h-ALS-SL；MS QQQ；1260 DAD；Column-SL；1260 BinPump1200Series Rapid Resolution LC System； pH值計(jì)；離心機(jī)(TGL-16G)；

試劑：烏頭堿( 批號:MUST-15013008) 、次烏頭堿( 批號:MUST-15090918) 和新烏頭堿( 批號: MUST-15091504) 苯甲酰烏頭原堿(MUST-15012215)苯甲酰次烏頭原堿(MUST-150108006)苯甲酰新烏頭原堿(MUST-16012816)對照品購自北京凱瑞恩科貿(mào)中心。訶子(批號：20140101，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國藥典》2010年版一部)，生草烏(批號：141001，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國藥典》2010年版一部)， 乙腈(色譜純，DikmaPure公司)，氨水(色譜純，F(xiàn)luKa公司)，醋酸銨(色譜純，DikmaPure公司)，乙醚(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)三氯甲烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)異丙醇(色譜純，DikmaPure公司)超純水(自制)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血漿的制備：稱取草烏及訶子湯炮制草烏干燥粉末加適量0.5%CMC，混勻，15只SD大鼠，隨機(jī)分為3組，每組5只，一組為空白組，其余2組為給藥組，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h(自由飲水)。給藥組大鼠稱重后，1mL/100g的體積灌胃給藥，給藥后1h腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈采血后放入肝素化采血管中，靜置30min，4℃，3000rpm離心15min，取上清液，合并同一組不同大鼠血漿備用?？瞻捉M同法灌胃給0.5%CMC溶液后采血，合并大鼠血漿作為空白血漿備用。

2.2 血漿中6 種生物堿的含量測定

2.2.1 色譜條件：色譜柱選擇ZORbax-Extend-C18 4.6×250mm 5-Micron 80A柱子分離，流動相為10mmol醋酸銨水溶液(氨水調(diào)pH=9.0)：乙腈，流速為1mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量2μL。

表1 時間梯度

2.2.2 質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源(ESI)：正離子檢測；毛細(xì)管出口電壓(v)：135；碰撞電壓(v)：40；Gas Temp (°C)： 300；Nebulizer (psi) ：45 ；Gas Flow (l/min)： 12 ；選擇離子檢測m/z 604(苯甲酰烏頭原堿)、m/z 590(苯甲酰新烏頭原堿)、m/z 574(苯甲酰次烏頭原堿)m/z 632(新烏頭堿)、m/z 646(烏頭堿)、m/z 616(次烏頭堿)。

2.2.3 對照品溶液的制備：取新烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、烏頭堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品適量，精密稱定 ，加異丙醇-三氯甲烷(1 : 1)混合溶液分別制成每lmL含1mg對照品的混合溶液，即得母液。

2.2.4 血漿樣品處理：取血漿樣品200μL，加25%的氨水混旋振蕩1min，再加乙醚1mL，混旋振蕩5min，10000rmp離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，?0μL異丙醇-三氯甲烷(1 : 1)混合溶液復(fù)溶。取40μL于自動進(jìn)樣器樣品瓶中，設(shè)定2μL進(jìn)樣檢測。

3 檢測結(jié)果及方法學(xué)考查

3.1 專屬性研究：取空白血漿、含藥血漿各200μL，采用2.2.4項(xiàng)下處理方法處理記錄色譜圖(圖1)。由圖可知在此色譜-質(zhì)譜條件下，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿峰形良好，血漿內(nèi)雜質(zhì)不干擾樣品測定。本實(shí)驗(yàn)中建立的方法測定草烏及其訶子湯炮制品中6種生物堿的含量結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(ng/mL)

新烏頭堿烏頭堿次烏頭堿苯甲酰新烏頭原堿苯甲酰次烏頭原堿苯甲酰烏頭原堿生草烏12.159073.0521370.8045531.696555.4003744.121718制草烏101.325625.4344590.0379264.137945.0031134.34765

3.2 線性范圍研究及定量下線：取對照品混合溶液母液，配制成不同濃度的系列對照品溶液分別放入9支EP管中，氮?dú)獯蹈?，再各管中加入空白血漿200μL，使各管標(biāo)準(zhǔn)品的最終濃度達(dá)到0.078、0.15625、0.3125 、0.625 、1.25、2.5、5、10、20ng/mL水平，按上述2.2.4方法處理后進(jìn)行HPLC—MS檢測，分別記錄新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的峰面積，以峰面積之比為縱坐標(biāo)，以相對應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取標(biāo)準(zhǔn)曲線的下限為定量下限，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的定量下限分別為0.078ng/mL。結(jié)果圖2表3。

表3 6種檢測成分的加樣最終濃度及血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

成分線性方程相關(guān)系數(shù)新烏頭堿y=1458.63x-97.010.9988次烏頭堿y=1295.76x-77.670.9988烏頭堿y=2307.97x-191.870.9983苯甲酰新烏頭原堿y=471.05x-5.400.9976苯甲酰次烏頭原堿y=1204.17x-114.320.9987苯甲酰烏頭原堿y=462.72x-24.450.9985

3.3 精密度研究：取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿混標(biāo)溶液吹干，各加空白兔血漿200μL，按配制成最終3種濃度血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度各5管。按血漿樣品處理方法處理后，同一日內(nèi)測定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度結(jié)果見表4。

表4 各成分精密度

3.4 萃取回收率與基質(zhì)效應(yīng)考查：配制混標(biāo)溶液高、中、低3個濃度，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL異丙醇-三氯甲烷(1：1)溶液復(fù)溶。測得響應(yīng)值為A；將高、中、低3個不同濃度的混標(biāo)吹干物上加入已經(jīng)處理好的空白血漿提取物混合制備，測得響應(yīng)值為B；將高、中、低3個不同濃度的混標(biāo)吹干物上加入空白血漿，提取制備，測得的響應(yīng)值為C。計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)(B/A)，回收率(C/B)。結(jié)果如表5。

表5 各成分萃取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

3.5 穩(wěn)定性研究：精密量取混標(biāo)溶液高、中、低3個濃度溶液氮?dú)獯蹈?，取空白血漿200μL加入吹干物中，按照血漿樣品處理方法處理，于室溫下放置0、2、4、8、12、24測定樣品，運(yùn)用其峰面積計(jì)算RSD，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿RSD分別為1.24%、1.97%、2.10%、4.47%、3.95%、3.69%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中建立了動物血漿中草烏及其訶子湯炮制品新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿同時檢測的HPLC-MS測定方法，具有準(zhǔn)確、靈敏、簡便、測得數(shù)據(jù)可靠的優(yōu)點(diǎn)，對目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性離子檢測，空白血漿無雜質(zhì)干擾。線性關(guān)系良好，血漿的萃取回收率高，6種物質(zhì)的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10%，適用于草烏的濃度監(jiān)控、藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。

[1]羅布桑.蒙藥學(xué)[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2006：185.

[2] 張小峰,松林,圖雅,等. 三種不同產(chǎn)地蒙藥草烏炮制前后三種烏頭堿含量的比較研究[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志, 2016, 卷缺失(2): 42-43.

[3] Aimin Sun, Bo Gao,?Xueqing Ding et al.? Quantitative and Qualitative Analysis of Aconitum Alkaloids in Raw and Processed Chuanwu and Caowu by HPLC in Combination with Automated Analytical System and ESI/MS/MS[J]. ?Analytical Methods in Chemistry.2012,doi:10.1155/2012/936131.

[4] 邱俏檬,劉剛,梁歡,等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法同時檢測兔血漿中3種草烏成分[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2009, 16(2): 106-108.

[5]韓志強(qiáng),巴圖德力根. 烘制法對不同質(zhì)地蒙藥草烏炮制效果的比較研究[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2015, 31(1): 67-69.

[6]曉華,張思遠(yuǎn),海平,等. 草烏中二萜生物堿的提取工藝及化學(xué)成分研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(2): 113-114.

2016年10月10日收稿

Content determination of six alkaloid compositions from Caowu and its Hezi decoction processed products in the plasma

Celi muge NIE Yin-lan LIANG Hui ZHANG Xiao-feng, Songlin Tuya

Mongolia medicine college in inner Mongolia medicine university huhhot 010110

Objective: A quantitative analysis method for simultaneous determination of six Alkaloid compositions from Cao Wu and its He Zi decoction processed products in the plasma was established by applying LC-MS. Methods: After ether extraction, the column was ZORbax-Extend-C18(4.6×250mm,5-Micron 80A); the mobile phase was acetonitrile - a buffer solution consisting of 10mmol/L ammonium acetate (ammonia pH=9.0?Regulation); m/z 604 (benzoyl aconite original base), m/z 590 (benzoyl new aconite original base), m/z 574 (benzoyl aconite original base) m/z 632 (new aconitine), m/z 646 (Aconitum alkaloids) and m/z 616 (Aconitum alkaloids) was selected by ion detection. Results: The linear correlation coefficients of six components were good, and the RSD of their precision, stability and matrix effects were all less than 10%; the average recovery was between 59.11% and 96.57%. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate,and can be applied to the determination of new aconitine, hypaconitine and aconitine, benzoyl new aconite original base, benzoyl aconite original base, aconite original base from the plasma which was provided further reference of study on pharmacokinetics and toxicokinetics of Cao Wu and its He Zi decoction processed products.

Aconiti kusnezoffii Radix; processed; processed with Chebulae Fructus; content determination

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81360677；No.81274192)

策力木格，碩士研究生，研究方向：蒙藥配伍規(guī)律研究，電話:15647135811，E-mail:875061667@qq.com

*通信作者:松林，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蒙藥配伍規(guī)律研究，炮制規(guī)范化研究，電話：0471-6657613 ，E-mail: songlinwps@163.com

R291.2

B

1006-6810(2017)01-0042-04