劉 暢，唐小飛，歐艷陽，劉海林，李海波

（第三軍醫(yī)大學：1藥學院學員18營，2原學員旅20隊，3藥學院微生物與生化藥學教研室，重慶400038）

·藥學與轉(zhuǎn)化醫(yī)學·

纖維素酶解法提取黃花蒿中青蒿素的工藝研究

劉 暢1，唐小飛2，歐艷陽2，劉海林2，李海波3

（第三軍醫(yī)大學：1藥學院學員18營，2原學員旅20隊，3藥學院微生物與生化藥學教研室，重慶400038）

目的：建立并優(yōu)化纖維素酶解法提取黃花蒿中青蒿素的最佳工藝條件.方法：以青蒿素的提取率為指標，通過正交實驗法對酶解濃度、酶解時間、提取時間和料液比四個因素進行優(yōu)選實驗.結(jié)果：最佳提取工藝：酶解濃度為0.05 mg／mL，酶解時間為30 min，提取時間為60 min，料液比為1∶80.與回流提取法相比青蒿素提取率提高了34.76%.結(jié)論：采用酶解法提取黃花蒿中的青蒿素，工藝方法簡單，可大大提高原料利用率，同時縮短提取時間.

黃花蒿；青蒿素；纖維素酶；提取工藝

0 引言

菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）中所含的青蒿素（Artemisinin，圖1）是由我國自主研發(fā)，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）認定為治療惡性瘧疾的有效藥物［1］.我國科學家屠呦呦因為發(fā)現(xiàn)抗瘧疾藥物青蒿素獲得2015年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎.我國所產(chǎn)的青蒿素占全球總產(chǎn)量的90%以上，而重慶又是我國最早開展黃花蒿人工種植的省市之一，依托重慶黃花蒿種植的資源優(yōu)勢，開展青蒿素提取工藝的研究對青蒿素的進一步產(chǎn)業(yè)化具有重要意義.

圖1 青蒿素的化學結(jié)構(gòu)

現(xiàn)有青蒿素的提取方法主要有傳統(tǒng)提取法和超臨界流體提取法兩種.傳統(tǒng)提取法包括回流提取法、冷浸提取法和索氏提取法等［2－4］.傳統(tǒng)提取法溶劑成本高，提取率和原料利用率較低，而超臨界流體法雖提取率高，但因設(shè)備昂貴，其普及受到限制［5－6］.根據(jù)傳質(zhì)理論，在天然活性成分的提取過程中，溶劑首先向固體表面擴散，滲透到固體表面，然后進入固體內(nèi)部及其微孔隙內(nèi)溶解天然活性成分，最后通過固體微孔隙向固體表面擴散，并在固體表面與溶劑主體間濃度差作用力下，天然活性成分向溶劑主體擴散，完成提取傳質(zhì)過程［7－8］.而青蒿素全部被纖維素構(gòu)成的細胞壁所包圍，傳統(tǒng)的提取方法無法使細胞壁破裂，因此存在巨大的傳質(zhì)阻力，致使提取效果受到很大的限制.近年研究表明，采用纖維素酶能使細胞壁疏松、破裂，減小傳質(zhì)阻力，可有效提高提取效率［9］，而采用酶解法提取黃花蒿中的青蒿素，鮮有文獻報道.本文以石油醚為提取溶劑，研究酶解濃度、酶解時間、液固比、提取時間等因素對提取率的影響，建立并選出酶解法提取黃花蒿中青蒿素的最佳工藝條件，現(xiàn)報道如下.

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑電子天平（上海精密科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實驗設(shè)備有限公司），雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），青蒿素標準品（中國藥品生物制品檢定所），黃花蒿藥材（產(chǎn)地重慶酉陽），纖維素酶（15 U／mg，上海博奧生物科技有限公司），95%乙醇［重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠］，氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠），石油醚，蒸餾水.

1.2 樣品的制備

1.2.1 纖維素酶解法樣品的制備 精確稱取50 mg纖維素酶，用蒸餾水溶解并定容于50 mL容量瓶中，配制得到濃度為15 U／mL的纖維素酶溶液.

取干燥黃花蒿葉樣品約1 g，加入20 mL稀硫酸溶液（pH為4.5）和定量的酶溶液，置于50℃恒溫水浴中，酶解一定時間后，抽濾，濾渣烘干至恒重.在濾渣中加入定量的石油醚，并于50℃條件下進行加熱.加熱一定時間后，冷卻至室溫，抽濾，濾液用2%的氫氧化鈉溶液（10 mL×2）進行洗滌，再用水洗至中性.最后在水浴溫度為50℃的條件下進行減壓濃縮，并用95%乙醇定容于50 mL容量瓶中，得纖維素酶解法樣品供試液.

1.2.2 回流提取法樣品的制備 稱取干燥黃花蒿葉樣品約1 g，加入60 mL石油醚，控制內(nèi)溫為50℃進行加熱.加熱一定時間后，冷卻至室溫，抽濾，濾液處理方法同纖維素酶解法，得回流提取法樣品供試液.

1.3 最大吸收波長的確定取青蒿素標準品10 mg，用95%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中.吸取上述溶液2 mL加入到50 mL容量瓶中，補加2 mL 95%乙醇，并用0.2%的氫氧化鈉溶液定容，得標準液.另外，將4 mL 95%乙醇加入到50 mL容量瓶中，并用0.2%的氫氧化鈉溶液定容，得空白液.

將標準液和空白液同時置于50℃恒溫水浴中反應30 min［10－11］.冷卻至室溫后用紫外分光光度計先用空白校正，然后對標準液進行紫外光譜掃描，標準液的最大吸收波長（λmax）為291 nm（文獻［12］λmax為292 nm）.

1.4 正交設(shè)計中提取液中青蒿素含量的測定為了簡化正交設(shè)計的實驗流程，提取液中青蒿素的含量按以下方法進行測定：

吸取提取液的續(xù)濾液2 mL于25 mL容量瓶中，補充2 mL 95%乙醇，加人0.2%氫氧化鈉溶液至刻度.再于50℃恒溫水浴中反應30 min，冷卻至室溫，在291 nm處測得吸光度值A(chǔ)S.并通過如下公式將其換算為每克黃花蒿葉所對應的吸光度值A(chǔ)H：

其中：MS——實際稱取的干燥黃花蒿葉的質(zhì)量.

青蒿素含量W計算公式：

其中：W——樣品的質(zhì)量，C——樣品的濃度，V——樣品的體積，E——百分吸收系數(shù)，L——比色杯的厚度，k——常數(shù).

2 結(jié)果

2.1 酶解法正交實驗與結(jié)果分析經(jīng)過預試驗發(fā)現(xiàn)，酶（15 U／mL）的用量（mL）、酶解時間（min）、回流時間（min）、石油醚的用量（mL）為影響青蒿素提取率的主要因素，以此設(shè)計四因素三水平正交實驗表（表1）.

表1 因素與水平

酶解法正交實驗結(jié)果如表2、3所示，從方差分析可知，四個因素對青蒿素提取率影響由大到小的順序如下：D＞A＞C＞B.說明溶劑體積的改變對青蒿素提取影響最大，其次為酶的用量和回流提取時間.其最佳組合為T4（D3A2C2B1）；即石油醚的用量為80 mL（料液比為1∶80），酶的用量為1.00 mL（反應體系中的濃度為0.05 mg／mL），提取時間為60 min，酶解時間為30 min.

表2 正交實驗結(jié)果

表3 青蒿素提取率方差分析

2.2 驗證試驗為了驗證正交試驗結(jié)果的準確性，按最佳提取工藝進行了重復性試驗.驗證性試驗結(jié)果表明所篩選的工藝具有可操作性和穩(wěn)定性（表4）.

表4 最佳提取工藝的驗證試驗

2.3 提取工藝對比分析纖維素酶解法：稱取250 g黃花蒿葉粉末，按照優(yōu)化后的參數(shù)用纖維素酶解法進行提取，提取液于50℃減壓濃縮，得粗品.精制后得青蒿素純品2.911 g.

回流提取法：稱取250g黃花蒿葉粉末，按回流提取法進行提取，精制后得青蒿素純品2.160 g.

纖維酶解法提取青蒿素所得收率較回流提取法提高了34.76%.

2.4 樣品的薄層色譜（TLC）分析取精制后的青蒿素以及青蒿素標準品各10 mg，加1 mL丙酮溶解，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（沸程60～90℃）?丙酮?冰醋酸（8∶2∶0.1）為展開劑，展開后取出，晾干，噴以含2%香草醛的20%硫酸乙醇溶液，在85℃加熱10～20 min至斑點清晰.樣品試液與標準試液相同位置處有相同顏色的斑點；在青蒿素斑點的前后無其它斑點，說明青蒿素的純度符合要求.

3 討論

青蒿素在丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯及冰醋酸中易溶，在乙醇、甲醇、乙醚及石油醚中可溶，在水中幾乎不溶［13］.綜合考慮青蒿素與雜質(zhì)在各個溶劑中的溶解度，采用石油醚作為提取的溶劑，并將其作為正交實驗的主要影響因素來進行研究.另外，利用青蒿素在水中幾乎不溶的特點，酶解反應選擇在水溶液中進行，并在萃取過程中用蒸餾水進行洗滌，除去樣品中的水溶性成分［14－15］.

青蒿素在溫度超過60℃的環(huán)境下過氧橋結(jié)構(gòu)很快被破壞，完全失去藥效，所以青蒿素的提取不宜使用較高的溫度，控制在50℃比較適宜［11］.從青蒿素的提取收率、提取時間、生產(chǎn)成本等指標綜合考慮，以T4（D3A2C2B1）為最優(yōu)組合，推薦為生產(chǎn)工藝.雖然T3（D3A1B3C3）的收率也比較高，但是耗時太長，并且長時間的加熱也可能導致青蒿素的分解，因此在生產(chǎn)過程中應避免采用.本提取方法與以往的冷浸提取法相比，大大縮短了提取的時間，減少了溶劑的容量，提高了青蒿素的收率.酶解法在天然活性成分的提取中有著重要的地位，并具有廣泛應用的潛力，除了應用于本研究提到的青蒿素的提取，也可考慮運用于其它研究中去，以提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本等.

［1］國家藥典委員會.中國藥典，一部［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：137，附錄ⅨH.

［2］Tian N，Li J，Liu S，et al.Simultaneous isolation of artemisinin and its precursors from Artemisia annua L.by preparative RP?HPLC［J］.Biomed Chromatogr，2012，26（6）：708－713.

［3］Nageeb A，Al?Tawashi A，Mohammad Emwas AH，et al.Comparison of artemisia annua bioactivities between traditional medicine and chemical extracts［J］.Curr Bioact Compd，2013，9（4）：324－332.

［4］Engeu PO，Omujal F，Agwaya M，et al.Variations in antimalarial components of Artemisia annua Linn from three regions of Uganda［J］.Afr Health Sci，2015，5（3）：828－834.

［5］Kohler M，Haerdi W，Christen P，et al.Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua L.using supercritical carbon dioxide［J］.J Chromatogr A，1997，785（1－2）：353－360.

［6］Ivanescu B，Miron A，Corciova A.Sesquiterpene lactones from arte?misia genus：biological activities and methods of analysis［J］.J Anal Methods Chem，2015，2015：247685.

［7］吳梅林，周春山，陳龍勝，等.酶法提取銀杏黃酮類化合物研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（6）：557－560.

［8］Pan S，Wu S.Cellulase?assisted extraction and antioxidant activity of the polysaccharides from garlic［J］.Carbohydr Polym，2014，111：606－609.

［9］Zhao YM，Song JH，Wang J，et al.Optimization of cellulase?assisted extraction process and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai［J］.J Sci Food Agric，2016，96（13）：4484－4491.

［10］趙 兵，王玉春，歐陽藩.青蒿藥用成分提取分離技術(shù)現(xiàn)狀［J］.中草藥，1998，29（11）：784－786.

［11］趙 兵，王玉春，吳 江，等.青蒿素提取條件研究［J］.中草藥，2000，31（6）：421－423.

［12］李春莉，王莎莉，王亞平，等.紫外分光光度法測定青蒿素的含量［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2007，32（4）：413－415.

［13］Kim MH，Seo JY，Liu KH，et al.Protective effect of artemisia annua L.extract against galactose?induced oxidative stress in mice［J］.PLoS One，2014，9（7）：e101486.

［14］Tang C，Zhao Y，Huang S，et al.Influence of Artemisia annua extract derivatives on proliferation，apoptosis and metastasis of osteo?sarcoma cells［J］.Pak J Pharm Sci，2015，28（2 Suppl）：773－779.

［15］Patindol J，Wang L，Wang YJ.Cellulase?assisted extraction of oligo?saccharides from defatted rice bran［J］.J Food Sci，2007，72（9）：C516－C521.

Study on extraction process of artemisinin from Artemisia annua L.by cellulase?assisted technique

LIU Chang1，TANG Xiao?Fei2，OU Yan?Yang2，LIU Hai?Lin2，LI Hai?Bo3
Third Military Medical University：1Battalion Eighteen，College of Pharmacy，2The 20th Team of Cadet Brigade，3Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy，College of Pharmacy，Chongqing 400038，China

AIM：To establish and optimize the extraction process of artemisinin from Artemisia annua L.by cellulase?assisted technique.METHODS：With the extraction rate of artemisinin as index，the orthogonal test was adopted to examine the effects of the 4 factors consisting of enzyme concentration，enzymatic hydrolysis time，the rate of liquid to material and extraction times.RESULTS：The optimum extraction conditions were established as following：enzymeconcentration 0.05mg／mL，enzymatic hydrolysis time 30 minutes，the rate of material to liquid 1：80，extraction time 60 minutes.The yield of artemisinin increased by 34.76%comparing with the traditional technique of extraction.CONCLUSION：The method is simple and it can increase material utility effectively，extracted time is reduced as well.

ArtemisiaannuaL.；artemisinin；cellulose；extraction process

R965.1

A

2095?6894（2017）04?64?04

2016－12－06；接受日期：2016－12－22

國家自然科學基金（31400788，31670936）

劉 暢.E?mail：756648273＠qq.com

李海波.副教授，碩士生導師.研究方向：化學生物學.

E?mail：lihaibo＠tmmu.edu.cn