朱蘭香 陳彥君 嚴 蘇 金月紅

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(215006)

炎癥性腸病血清學抗體的臨床意義

朱蘭香*陳彥君#嚴 蘇 金月紅

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(215006)

背景：對于炎癥性腸病(IBD)，迄今尚無疾病診斷和監(jiān)測的金標準。鑒于免疫系統(tǒng)在IBD發(fā)病中的重要作用，檢測血清免疫特異性抗體水平對于IBD的診斷和鑒別診斷可能有一定價值。目的：探討血清抗釀酒酵母抗體(ASCA)和核周型抗中性粒細胞胞質抗體(pANCA)在IBD中的臨床意義。方法：連續(xù)納入2015年2月—2016年5月蘇州大學附屬第一醫(yī)院收治的IBD患者91例，其中克羅恩病(CD)52例，潰瘍性結腸炎(UC)39例，36例排除IBD的胃腸道疾病患者作為對照組。分別采用ELISA法和間接免疫熒光法檢測血清ASCA-IgG、IgA和pANCA。以臨床診斷為金標準，采用四格表對ASCA、pANCA進行診斷試驗評價；采用ROC曲線、Pearson χ2檢驗、Fisher精確檢驗分析兩種血清學抗體與IBD、CD、UC以及病變部位的關系。結果：血清ASCA-IgG和IgA均與CD相關(AUC=0.626 和0.614)，而UC僅與ASCA-IgA相關(AUC=0.486)。血清pANCA與IBD(r=0.342)、CD(r=-0.262)、UC(r=0.614)均相關，對IBD和UC的診斷敏感性和特異性優(yōu)于CD(P<0.05)。CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關(P<0.05)，pANCA與病變累及結腸相關(P<0.05)；UC患者的ASCA-IgG、IgA均與病變累及回腸末端相關(P<0.05)。結論：血清ASCA、pANCA有助于在IBD診斷確立的基礎上區(qū)分CD與UC，并可能對病變部位具有提示作用。ASCA可能與病變累及回腸末端相關，而pANCA則可能與病變累及結腸相關。

炎癥性腸??； Crohn??； 結腸炎，潰瘍性； 抗釀酒酵母抗體； 核周型抗中性粒細胞胞質抗體； 診斷，鑒別

近年來我國炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的發(fā)病率呈上升趨勢，關于其病因，目前普遍認為是腸道菌群在易感宿主中觸發(fā)異常免疫反應，引起腸道慢性炎癥。鑒于免疫系統(tǒng)在IBD發(fā)病中的重要作用，檢測血清免疫特異性抗體水平對于IBD的診斷和鑒別診斷可能有一定價值。既往研究提出抗釀酒酵母抗體(anti-Saccharomycescerevisiae antibody, ASCA)和核周型抗中性粒細胞胞質抗體(perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic anti-body, pANCA)分別對克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)有一定的診斷敏感性[1]。本研究旨在進一步探討血清IgG型、IgA型ASCA和pANCA在IBD中的臨床意義。

對象與方法

一、病例來源

連續(xù)納入2015年2月—2016年5月蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科住院和門診IBD患者91例，其中CD 52例，男性38例，女性14例，平均年齡(38.32±4.51)歲；UC 39例，男性12例，女性27例，平均年齡(36.83±4.52)歲。CD和UC的診斷符合2012年中華醫(yī)學會消化病學分會IBD學組制訂的診斷標準[2]。同期36例排除IBD的其他胃腸道 疾病(慢性非萎縮性胃炎、慢性結腸炎等)患者作 為對照組，男性12例，女性24例，平均年齡(39.75±6.75)歲。

二、方法

1. 標本采集：所有受檢者采集晨起空腹靜脈血2 mL，離心收集血清。

2. 血清抗體檢測：ASCA-IgG、IgA的檢測采用ELISA法，pANCA的檢測采用間接免疫熒光法，試劑盒為德國歐蒙公司產品。

①ASCA-IgG、IgA：于微孔板各孔中分別加入標準血清(Cal1 200 U/mL、Cal2 20 U/mL、Cal3 2 U/mL)、陽性對照、陰性對照和1∶101稀釋的待測血清各100 μL，室溫孵育30 min，300 μL洗滌緩沖液洗滌4次；分別于ELISA微孔內加入100 μL HRP標記抗人IgG或IgA抗體，室溫孵育30 min，300 μL洗滌緩沖液洗滌4次；加入100 μL底物，避光室溫孵育15 min，加入100 μL終止液。以酶標儀(比色波長450 nm，參考波長620 nm)測定吸光度(A)值，以Cal2的A值為界值對結果進行定性分析。ASCA-IgG和(或)IgA陽性判定為ASCA陽性。

②pANCA：取11.1 μL待測血清樣本，加入PBS 100 μL，旋渦混合器振蕩25 s；取25 μL稀釋血清加于反應板上，覆上包被抗原基質的基質片，室溫孵育 30 min；基質片以PBS沖洗1 s后浸泡5 min；于清潔加樣板的反應區(qū)滴加20 μL羊抗人IgG熒光抗體，從PBS中取出基質片，5 s內以吸水紙擦拭，將覆有基質的一面朝下蓋在加樣板凹槽內，避光孵育30 min；取出基質片，沖洗、浸泡；于蓋玻片上滴加甘油/PBS 10 μL，從PBS中取出基質片、擦拭，將覆有基質的一面朝下蓋在蓋玻片上，熒光顯微鏡下定性觀察，滴度>1∶10 判定為陽性。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件，以臨床診斷為金標準，采用四格表進行診斷試驗評價，分別計算ASCA、pANCA在IBD、CD、UC中的敏感性、特異性、陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)并作χ2檢驗。ASCA、pANCA與IBD、CD、UC關系的分析：計數(shù)資料ASCA繪制ROC曲線，分析曲線下面積(AUC)；計量資料pANCA行Pearson χ2檢驗、Fisher精確檢驗。ASCA、pANCA與病變部位關系的分析采用Pearson χ2檢驗、Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、ASCA、pANCA診斷試驗評價

IBD、CD、UC患者血清ASCA-IgG、ASCA-IgA、pANCA檢測陽性例數(shù)見表1。四格表分析顯示，ASCA在IBD、CD、UC中的敏感性均在40%左右，特異 性分別為88.89%、74.67%和71.59%，提示ASCA對排除非IBD患者有一定意義；而pANCA在UC中的敏感性和特異性相對較高，分別為61.54%和94.32%，提示其為輔助診斷UC的特異性指標(表2)。

表1 IBD、CD、UC患者血清ASCA、pANCA檢測陽性例數(shù)(n)

表2 血清ASCA、pANCA診斷試驗評價

二、ASCA、pANCA對IBD、CD、UC的診斷意義

血清ASCA-IgG、ASCA-IgA分別診斷IBD、CD、UC的ROC曲線見圖1。分析顯示，IBD與ASCA-IgG相關(AUC=0.365,P=0.018)，UC與ASCA-IgA相關(AUC=0.486,P=0.002)，CD與ASCA-IgG(AUC=0.626,P=0.016)和ASCA-IgA(AUC=0.614,P=0.030)均相關。上述發(fā)現(xiàn)提示IBD分型與ASCA分型可能相關。

Pearson χ2檢驗/Fisher精確檢驗顯示，血清pANCA與IBD(r=0.342,P=0.000 082)、CD(r=-0.262,P=0.003)、UC(r=0.614,P=0.000 1)均有一定相關性，其對IBD和UC的診斷敏感性和特異性優(yōu)于CD(χ2=27.672,P=9.797×10-7)。

三、ASCA、pANCA對IBD病變部位的提示作用

結合蒙特利爾分型[2]對本組CD和UC患者的病變部位進行分類：CD分為較多累及回腸末端型(L1/L4)和較多累及結腸型(L2/L3)，L1/L4和L2/L3型分別為23例和29例；UC分為僅累及遠端結腸型(E1/E2)和較多累及結腸和回腸末端型(E3)，E1/E2和E3型分別為24例和15例。

19例血清ASCA-IgG陽性CD患者中12例為累及回腸末端型(L1/L4)，Pearson χ2檢驗/Fisher精確檢驗顯示，CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關(χ2=4.348,P=0.036)。5例血清pANCA陽性CD患者均為累及結腸型(L2/L3)，Pearson χ2檢驗/Fisher精確檢驗顯示，CD患者的pANCA與病變累及結腸相關(χ2=4.387,P=0.046)(表3)。

12例血清ASCA-IgG陽性UC患者中9例為累及回腸末端型(E3)，6例血清ASCA-IgA陽性UC患者 均為累及回腸末端型(E3)，Pearson χ2檢驗/Fisher精確檢驗顯示，UC患者的ASCA與病變累及回腸末端相關(ASCA-IgG: χ2=9.777,P=0.003; ASCA-IgA: χ2=11.345,P=0.002)(表3)。

討 論

對于IBD，迄今尚無疾病診斷和監(jiān)測的金標準。臨床實踐中，CD與UC的鑒別有一定難度，特別是在患者的臨床表現(xiàn)、內鏡和病理特征不典型或有疑惑時，而一些血清生物學標記物如免疫特異性抗體可能有助于部分解決這一問題[3]。

ASCA是針對釀酒酵母菌細胞壁磷肽甘露聚糖的抗體，在部分CD患者的血清中特異性升高[4]，腸內細菌的胞壁成分與釀酒酵母菌胞壁甘露聚糖成分同源。ASCA有IgG和IgA兩種免疫球蛋白亞型。

圖1 血清ASCA診斷IBD、CD、UC的ROC曲線

表3 血清ASCA、pANCA對IBD病變部位的提示作用

抗體CD(n)L1/L4L2/L3Pearsonχ2Fisher單側P值UC(n)E1/E2E3Pearsonχ2Fisher單側P值ASCA?IgG1274．3480．036399．7770．003ASCA?IgA632．2210．1310611．3450．002pANCA054．3870．04612123．5100．061

本研究以臨床診斷為金標準，對血清ASCA進行診斷試驗評價，結果顯示其在IBD、CD、UC中的敏感性均較低(約40%)，特異性為71.59%～88.89%。ROC曲線分析顯示ASCA與IBD、CD、UC均相關，具體表現(xiàn)為ASCA-IgG與IBD相關，ASCA-IgA與UC相關，兩類抗體均與CD相關，提示IBD分型與ASCA分型可能相關。國內樣本量較大的病例對照研究均顯示ASCA對CD的敏感性較低，與本研究結果一致[5-7]。有研究顯示CD患者的父母以及一級親屬血清ASCA水平升高，可能與CD相關NOD2基因突變有關[8]，表明ASCA是有罹患CD傾向者免疫系統(tǒng)過度應答的血清學表現(xiàn)形式。

50%～80%的UC患者外周血中可檢出ANCA，UC相關ANCA在乙醇固定的中性粒細胞中呈核周染色形式，即pANCA[9]。pANCA系由腸黏膜B細胞所產生，以中性粒細胞和單核細胞胞質成分為抗原，可作用于毛細血管中的中性粒細胞、單核細胞和腸上皮細胞，引起溶菌酶釋放，導致大面積血管和腸組織損害[10-12]。本研究中血清pANCA對UC的敏感性和特異性分別為61.54%和94.32%，敏感性與國內同類研究接近(54.7%～56.7%[5-7])。國外研究中pANCA在UC中的陽性率/敏感性亦均在55%～60%[12-14]，但也有超過65%者[15]。本研究結果顯示pANCA在CD中的診斷價值顯著低于UC和IBD，其與UC相關性最強(r=0.614)，其次為IBD(r=0.342)，與CD相關性最弱(r=-0.262)，提示pANCA可在IBD診斷確立后UC與CD的鑒別中發(fā)揮作用，為UC特異性血清學標記物。

本研究相關性分析還顯示，CD患者的ASCA-IgG與病變累及回腸末端相關，pANCA與病變累及結腸相關，而UC患者的ASCA-IgG、IgA均與病變累及回腸末端相關。既往研究亦表明累及回腸末端型CD(L1/L4)血清ASCA多為陽性，UC反向累及回腸(E3)時，ASCA亦可呈陽性，而累及結腸的CD(L2/L3)ASCA陽性率較低[3，8]。上述相關性可能與腸道局部免疫、食物抗原以及腸道菌群的變化有關。

IBD遺傳易感個體的機體免疫機制缺乏規(guī)律性，先天免疫敏感性以及腸道共生細菌的再激活可能激活一系列炎癥反應通路，導致大量炎癥因子釋放，炎癥細胞激活，血液中的淋巴細胞、炎癥性白細胞和單核細胞募集至腸道。回腸腸壁較薄，管徑較小，腸系膜內血管弓多、直血管短，有大量孤立和集合淋巴濾泡，且多見于回腸下段，是腸道局部免疫應答的重要場所。而結腸內除與動靜脈伴行的淋巴系統(tǒng)外，并無此種特殊的淋巴濾泡，免疫應答潛能較回腸弱。因此，累及回腸的病變可能釋放更多炎癥因子，共生細菌再激活程度加劇，細菌胞壁中與ASCA針對的釀酒酵母菌胞壁甘露聚糖同源的成分相應增多。ASCA可能是對菌體本身的抗原反應所致，也可能是由目前尚未被鑒定的交叉抗原所引起[16]。而ANCA是一組以中性粒細胞和單核細胞胞質成分為抗原的自身抗體，根據(jù)免疫熒光檢測時的分布可分為胞質型(cANCA)、斑點型(sANCA)和核周型(pANCA)。目前觀點認為ANCA只是免疫調節(jié)紊亂的標志，可能與感染相關[10-12]。與回腸相比，結腸更易暴露于外界病原體，引發(fā)局部炎癥反應，故結腸病變pANCA表達增多。

腸道部位不同，抗原種類不同，相應抗體亦存在差異。小腸內以食物抗原為主，激活腸黏膜異常免疫應答，淋巴細胞聚集，ASCA表達增加。胃腸道內細菌數(shù)量從胃至結腸呈遞增趨勢，結腸內細菌數(shù)量達到最高水平[17]，因此結腸內以細菌抗原為主。pANCA能識別結腸細菌表位和肥大細胞胞質抗原，對共生微生物產生異常免疫應答[10-12]，因此在結腸炎癥時表達增加。此外，不同腸道部位菌群構成的差異亦可能影響ASCA、pANCA表達水平。小腸菌群的構成介于胃與結腸之間，近端與胃相近，能分離出大腸桿菌和厭氧菌；遠端則與結腸相近，大腸桿菌恒定存在，厭氧菌如類桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬亦有相當數(shù)量。不同菌群種類所含抗原成分的差異導致相應抗體表達水平的差異。確切機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IBD分型與ASCA分型可能相關，而pANCA在UC中的診斷價值高于CD，因此這兩個血清學抗體有助于在IBD診斷確立的基礎上區(qū)分CD與UC。更為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)血清ASCA、pANCA可能對IBD病變部位具有提示作用。血清ASCA-IgG與CD病變累及回腸末端相關，UC反向累及回腸時，ASCA-IgG、IgA亦可呈陽性，提示ASCA可能與IBD病變累及回腸末端相關，而血清pANCA則可能與病變累及結腸相關。上述相關性有待進一步研究證實，目前僅依靠血清學抗體檢測仍難以鑒別結腸型CD(L2/L3)與累及回腸末端的UC(E3)。

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(2016-10-06收稿；2016-12-17修回)

Clinical Significance of Serum Antibodies in Inflammatory Bowel Disease

ZHULanxiang,CHENYanjun,YANSu,JINYuehong.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

CHEN Yanjun, Email: 614695437@qq.com

Inflammatory Bowel Disease; Crohn Disease; Colitis, Ulcerative; Anti-SaccharomycescerevisiaeAntibody; Perinuclear Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody; Diagnosis, Differential

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.009

*Email: zhulanxiang0125@163.com

#本文通信作者，Email: 614695437@qq.com

Background: There is no gold standard for the diagnosis and monitoring of inflammatory bowel disease (IBD). As immune system plays crucial role in the pathogenesis of IBD, some immune-specific serum antibodies are considered to be useful tools for the diagnosis and differential diagnosis of the disease. Aims: To investigate the clinical significance of serum antibodies, including anti-Saccharomycescerevisiaeantibody (ASCA) and perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody (pANCA) in IBD. Methods: Serum samples were obtained from 91 consecutive IBD patients from Feb. 2015 to May 2016 at the First Affiliated Hospital of Soochow University. Of them, 52 were Crohn’s disease (CD) and 39 were ulcerative colitis (UC). Serum samples of 36 non-IBD patients were served as controls. ASCA-IgG and ASCA-IgA were detected by ELISA, and pANCA by indirect immunofluorescence assay. Using clinical diagnosis as gold standard, crosstabs statistics was performed to measure the diagnostic accuracy of ASCA and pANCA, and ROC curve, Pearson Chi-square test and Fisher’s exact test were employed for analyzing the correlations of these two serum antibodies with IBD, CD, UC, and the location of the disease. Results: Both serum ASCA-IgG and IgA were correlated with CD (AUC=0.626 and 0.614), while UC was correlated with ASCA-IgA only (AUC=0.486). Serum pANCA had relevance to IBD (r=0.342), CD (r=-0.262) and UC (r=0.614); its sensitivity and specificity for IBD and UC were superior to those for CD (P<0.05). In CD patients, ASCA-IgG was associated with terminal ileal disease (P<0.05), and pANCA was associated with colonic involvement (P<0.05). In UC patients, both ASCA-IgG and IgA were correlated with terminal ileal disease (P<0.05). Conclusions: Serum ASCA and pANCA may be helpful for discrimination between CD and UC when the diagnosis of IBD is established. Furthermore, they are closely associated with the disease location, ASCA is related with the terminal ileal disease and pANCA is related with colonic involvement.