高鴻亮 周 禾 姚 萍

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(830000)

維生素D3對結(jié)腸炎大鼠腸黏膜Toll樣受體4表達(dá)的影響*

高鴻亮#周 禾 姚 萍△

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(830000)

背景：近年我國潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的患病率明顯增高，Toll樣受體4(TLR4)與UC的發(fā)生、發(fā)展可能密切相關(guān)。目的：探討維生素D3對結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜TLR4表達(dá)的影響。方法：將30只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組和維生素D3組。模型組和維生素D3組大鼠給予三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸制備結(jié)腸炎模型，維生素D3組給予膽維丁乳灌腸。行HE染色，評估疾病活動指數(shù)(DAI)和組織病理學(xué)評分，采用免疫組化法檢測結(jié)腸組織TLR4表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組相比，模型組DAI、組織病理學(xué)評分顯著增高(P<0.05)，結(jié)腸組織TLR4表達(dá)顯著增高(P<0.05)。給予維生素D3干預(yù)后，DAI、組織病理學(xué)評分顯著降低(P<0.05)，TLR4表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TLR4高表達(dá)，可能與UC發(fā)病有關(guān)。維生素D3可通過抑制TLR4表達(dá)減輕結(jié)腸炎大鼠的腸道炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮輔助治療UC的作用。

結(jié)腸炎，潰瘍性； 膽骨化醇； Toll樣受體4

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種非特異性腸道炎癥性疾病，具有慢性、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。UC以潰瘍?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)，病變主要局限于黏膜層和黏膜下層。近年隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和飲食習(xí)慣的改變，我國UC的患病率明顯增高[1-3]。目前UC的病因和確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，多種因素參與其發(fā)病。UC治療效果并不理想，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列為現(xiàn)代難治病之一。動物實(shí)驗(yàn)[4]發(fā)現(xiàn)，1,25-二羥基維生素D3有抑制腸道炎癥的作用。維生素D3是維生素D中生物代謝率最高的一種活性形式，已在多種自身免疫病中發(fā)現(xiàn)其具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[5]，特別是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病。維生素D3對免疫的調(diào)控途徑之一為調(diào)控抗原呈遞細(xì)胞(APC)上Toll樣受體(TLRs)家族的表達(dá)及其功能。本研究通過給予結(jié)腸炎大鼠維生素D3治療，并檢測TLR4的表達(dá)，旨在闡明維生素D3治療UC的可能機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用維生素D3提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑

1. 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(230±40) g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)1周。

2. 主要試劑：2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購于Sigma公司；膽維丁乳(商品名：英康利)原液購于北京索萊寶科技有限公司；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體購于Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗、DAB顯色劑等購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、研究方法

1. 模型制備和分組：按隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為正常對照組、模型組和維生素D3組，每組10只。造模前，模型組和維生素D3組大鼠禁食24 h并稱重，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，將8FR小兒導(dǎo)尿管緩慢插入肛門約8 cm處。5% TNBS與50%乙醇等體積混合，0.4 mL/100 g緩慢注入大鼠腸道，保持肛門高位5 min，以防止藥液流出[6]。正常對照組以等量0.9% NaCl溶液灌腸。灌腸24 h后分別從模型組和正常對照組中隨機(jī)抽取2只大鼠，處死后觀察結(jié)腸組織情況，判斷模型的制備情況。維生素D3組造模成功后第2天給予膽維丁乳原液(每支含維生素D330萬單位/8 mL)1 875 U 灌胃，每天1次，持續(xù)10 d。正常對照組和模型組給予等量0.9% NaCl溶液灌胃。

2. HE染色：藥物干預(yù)第10天，麻醉大鼠，仰臥位固定于動物手術(shù)臺，分別切取潰瘍、充血水腫明顯處約1 cm的結(jié)腸末端、結(jié)腸中部、結(jié)腸起始處腸段，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片，行HE染色。鏡下觀察結(jié)腸黏膜病理改變，按Cooper等[7]的方法行組織病理學(xué)評分。

3. 疾病活動指數(shù)(DAI)[7]：造模后每日觀察大鼠體質(zhì)量變化、糞便性狀、血便和糞便隱血情況，計(jì)算DAI。

4. 免疫組化染色：石蠟切片經(jīng)脫蠟、封閉、抗原熱修復(fù)后，加兔抗大鼠多克隆抗體TLR4(工作濃度 1∶100)；滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗；顯色；復(fù)染；封片。以PBS液代替一抗作為空白對照。

結(jié)果判斷[8]：以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，以陽性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度評分之和作為染色評分。陽性細(xì)胞數(shù)<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強(qiáng)度：不著色，0分；淺黃色，1分；棕色，2分；深棕色，3分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況和DAI

正常對照組大鼠活動如常，毛色亮澤，飲食正常，活躍好動，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，糞便性狀正常。模型組大鼠灌腸后第1天出現(xiàn)少動，食欲不佳，毛發(fā)粗糙、無光澤，肛周皮毛被糞便污染，排便次數(shù)增多且多為稀便，體質(zhì)量明顯減輕。維生素D3組灌胃1周后食欲較模型組改善，活動度增加，排便轉(zhuǎn)為糊狀便或正常。與正常對照組相比，模型組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，DAI顯著增高(P<0.05)；給予維生素D3干預(yù)后，體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，DAI顯著降低(P<0.05)(表1)。

二、組織病理學(xué)評分

正常對照組大鼠腸壁結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮完整，細(xì)胞排列整齊，固有層杯狀細(xì)胞豐富，腺體排列規(guī)則，僅見少量散在炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠黏膜上皮細(xì)胞大量破壞，固有層杯狀細(xì)胞減少、腺體排列紊亂、纖維組織增生，黏膜層、黏膜下層大量炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤，隱窩膿腫形成。維生素D3組病理損害較模型組有不同程度減輕(圖1)。與正常對照組相比，模型組組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)；給予維生素D3干預(yù)后，組織病理學(xué)評分顯著降低(P<0.05)(表1)。

三、免疫組化染色

A：正常對照組；B：模型組；C：維生素D3組

組 別例數(shù)體質(zhì)量(g)DAI組織病理學(xué)評分TLR4表達(dá)正常對照組10167．8±5．3 001．86±0．80 模型組1096．0±6．4?4．35±0．67?1．69±0．33?6．12±0．60?維生素D3組10133．5±2．1?#2．28±1．22?#0．43±0．01?#4．09±0．90?#

*與正常對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

TLR4在正常對照組和維生素D3組大鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層和固有層中的表達(dá)較弱，而在模型組黏膜表面炎性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜中強(qiáng)表達(dá)，可見棕黃色顆粒，且上皮表達(dá)呈連續(xù)性，越接近上皮部位，表達(dá)越強(qiáng)(圖2)。與正常對照組相比，模型組TLR4表達(dá)顯著增高(P<0.05)；給予維生素D3干預(yù)后，TLR4表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表1)。

討 論

UC患者存在自身免疫功能失衡，腸黏膜伴有大量炎性細(xì)胞聚集，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起并放大黏膜炎癥。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫反應(yīng)異常是UC發(fā)病的主要原因[9]。UC在患病群體中有年輕化趨勢，對個(gè)體健康、生活和工作帶來巨大影響。近年發(fā)現(xiàn)維生素D除對鈣、磷的代謝具有調(diào)節(jié)作用外，在抗感染和調(diào)節(jié)免疫方面亦有廣泛作用[10-12]。維生素D可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能，其活性形式通過直接或間接作用抑制炎癥性腸病(IBD)致病T細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞從而抑制IBD發(fā)展，故維生素D可能對IBD的發(fā)病產(chǎn)生影響。同時(shí)，IBD患者容易發(fā)生骨量減少和骨質(zhì)疏松，從而大大增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)，使患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。

目前，越來越多的證據(jù)支持TLRs與UC的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[13]。TLRs是一種重要的模式識別受體，廣泛表達(dá)于天然免疫細(xì)胞和特異性免疫細(xì)胞表面，與病原生物上的配體結(jié)合，從而啟動非特異性免疫應(yīng)答，釋放白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-8、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-12、B7分子、一氧化氮合成酶等細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TLR4引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病的發(fā)病中起有重要作用[14-15]。維生素D3通過TLRs信號通路可影響初始T細(xì)胞的分化，使組織中Treg細(xì)胞和Th1細(xì)胞的比例發(fā)生變化。隨著對腸黏膜免疫的深入研究，越來越多證據(jù)顯示腸黏膜上皮細(xì)胞除作為固有屏障的作用外，還可作為免疫活性細(xì)胞參與腸黏膜天然免疫反應(yīng)。腸黏膜上皮細(xì)胞將腔內(nèi)高濃度抗原與黏膜免疫系統(tǒng)分隔開來，并分泌黏液形成黏液層。在受抗原刺激或致病微生物的入侵時(shí)腸黏膜上皮還能通過表達(dá)MHC-Ⅱ類抗原，參與抗原呈遞，將信號傳遞至固有層內(nèi)的炎性細(xì)胞，而且自身能表達(dá)并釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽，如IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-α、GM-CSF、IL-8等。

A：正常對照組；B：模型組；C：維生素D3組

本研究發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜微弱表達(dá)TLR4，說明正常大鼠通過下調(diào)細(xì)胞表面TLR4表達(dá)，使腸道對細(xì)菌產(chǎn)生良好耐受能力，減少細(xì)胞對細(xì)菌抗原的識別，減輕腸黏膜的免疫反應(yīng)。模型組大鼠腸黏膜TLR4表達(dá)較正常對照組明顯增加，且病理結(jié)果示腸黏膜出現(xiàn)腺體結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜上皮細(xì)胞破壞，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)，提示TLR4在UC的發(fā)病中起有一定作用，可能參與UC的發(fā)生、發(fā)展，與Hausmann等[16]的研究結(jié)果一致。而采用維生素D3干預(yù)后，大鼠飲食、毛色、體質(zhì)量、精神狀況等一般狀態(tài)明顯改善，組織病理炎癥反應(yīng)以及TLR4表達(dá)有不同程度的改善，說明維生素D3可抑制TLR4表達(dá)，減少了細(xì)菌抗原物質(zhì)觸發(fā)異常免疫反應(yīng)的機(jī)會，有效緩解了TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。

綜上所述，結(jié)腸炎大鼠TLR4表達(dá)明顯增加，而維生素D3可通過抑制腸黏膜上皮細(xì)胞TLRs介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用。為臨床應(yīng)用維生素D3輔助治療UC提供了良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但研究結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(2016-09-21收稿；2016-11-02修回)

Effect of Vitamin D3on Expression of Toll-like Receptor 4 in Intestinal Mucosa in Colitis Model in Rats

GAOHongliang,ZHOUHe,YAOPing.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi(830000)

YAO Ping, Email: pingyaozh@sina.com

Colitis, Ulcerative; Cholecalciferol; Toll-Like Receptor 4

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.008

*本課題由新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015211C087)資助

#Email: gaohongliang2008@163.com

△本文通信作者，Email: pingyaozh@sina.com

Background: The prevalence of ulcerative colitis (UC) in China has significantly increased in recent years, and Toll-like receptor 4 (TLR4) may be closely related to the development of UC. Aims: To study the effect of vitamin D3on expression of TLR4 in the intestinal mucosa in colitis model in rats. Methods: Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, model group and vitamin D3group. Rats in model group and vitamin D3group were given trinitro-benzene-sulfonic acid (TNBS) to induce colitis model. Rats in vitamin D3group were given vitamin D3. HE staining was performed, and disease activity index (DAI) and colon histopathological score were evaluated, the expression of TLR4 was measured by immunohistochemistry. Results: Compared with normal control group, DAI and histopathological score in model group were significantly increased (P<0.05), and expression of TLR4 was significantly increased (P<0.05). After giving vitamin D3, DAI and histopathological score were significantly decreased (P<0.05), and expression of TLR4 was significantly decreased (P<0.05). Conclusions: The expression of TLR4 is increased in colon tissue in colitis model in rats, which may be involved in the pathogenesis of UC. Vitamin D3can alleviate intestinal inflammation via inhibiting expression of TLR4, thereby playing a role in the adjunctive therapy of UC.