李穎 陳欣欣 趙穎 劉亞麗 王賀 張小江 楊啟文 徐英春

?

·論著·

全自動智能染色機對臨床微生物標(biāo)本染色性能的評估

李穎 陳欣欣 趙穎 劉亞麗 王賀 張小江 楊啟文 徐英春

目的 評估全自動智能染色機在臨床微生物標(biāo)本革蘭染色、萋-尼抗酸染色和熒光抗酸染色方面的染色性能。方法 收集不同類型臨床微生物標(biāo)本103份，依據(jù)不同的染色需求予以革蘭染色、萋-尼抗酸染色和熒光抗酸染色，同時進(jìn)行手工法和全自動智能染色機染色操作，以手工法染色結(jié)果為參照，從染色結(jié)果一致率、染色效率、易操作性及安全性等方面評估全自動智能染色機的染色性能。結(jié)果 全自動智能染色機在不同類型臨床微生物標(biāo)本染色方面總體效果好，其對臨床微生物標(biāo)本的革蘭染色[100% (58/58)]、萋-尼抗酸染色[100% (45/45)]和熒光抗酸染色[100% (45/45)]效果與手工法染色結(jié)果一致，且全自動智能染色機較手工染色法具有高通量、省時省力、易操作、穩(wěn)定性好、無污染等優(yōu)點。結(jié)論 全自動智能染色機對臨床微生物標(biāo)本具有良好的染色性能。

臨床實驗室技術(shù)； 染色與標(biāo)記； 分枝桿菌屬； 對比研究

近年來，醫(yī)學(xué)微生物領(lǐng)域發(fā)生著巨大的變革，許多傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)已逐漸被簡便、快捷的新技術(shù)與自動化機器取代，如法國梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek 2 compact和美國BD公司生產(chǎn)的Phoenix 100全自動微生物鑒定及藥物敏感性分析系統(tǒng)基本取代了傳統(tǒng)的微生物手工生化鑒定，全自動血培養(yǎng)儀、飛行時間質(zhì)譜等技術(shù)也正在微生物檢測與鑒定領(lǐng)域大展身手[1-3]。臨床微生物標(biāo)本直接染色是微生物檢驗中最基本且重要的環(huán)節(jié)。通過染色可以根據(jù)菌體的著色性、有無特殊結(jié)構(gòu)、排列分布方式等大致獲得標(biāo)本中的菌體類型和荷菌量等相關(guān)信息，對于輔助臨床診斷及指導(dǎo)經(jīng)驗性用藥具有重要意義。臨床上常用的細(xì)菌染色方法有革蘭染色，萋-尼抗酸染色和熒光抗酸染色等方法；其中，革蘭染色應(yīng)用最多，萋-尼抗酸染色法和熒光抗酸染色法則主要應(yīng)用于分枝桿菌等某些不易著色病原體[4-5]。目前，國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院對細(xì)菌染色仍然采用傳統(tǒng)的手工染色法，該方法需要連續(xù)的多個步驟，包括初染、媒染、脫色、復(fù)染、流水沖洗等，并且每個步驟都有明確規(guī)定的染色時間，超時或染色時間不足將嚴(yán)重影響標(biāo)本的著色效果，繼而干擾閱片人員的判斷。此外，通量低、人力消耗大、穩(wěn)定性差、易污染周邊環(huán)境等也是手工染色法的弊端。自動染色機具有染色程序自動化、高通量、染色效果穩(wěn)定等優(yōu)點，近些年來越來越受到檢驗人員的青睞。筆者擬對韓國Standard公司生產(chǎn)的KS-S100全自動智能染色機在臨床微生物標(biāo)本革蘭染色、萋-尼抗酸染色及熒光抗酸染色方面的染色性能進(jìn)行檢驗，評估其應(yīng)用價值。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本收集：按照評估實驗需求，收集2016年3—5月北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科微生物室接收的臨床患者送檢標(biāo)本，包括呼吸道標(biāo)本、便標(biāo)本、拭子標(biāo)本、無菌體液標(biāo)本等。其中，對于革蘭染色，共收集43份臨床送檢標(biāo)本，另收集臨床分離菌株15株。對于萋-尼抗酸染色及熒光抗酸染色法，共收集分枝桿菌陽性痰標(biāo)本14份，其中菌量+～++痰標(biāo)本10份，菌量+++～++++痰標(biāo)本4份；另收集分枝桿菌陰性痰標(biāo)本31份。

2.試劑和機器：手工用革蘭染色液、萋-尼抗酸染色液、熒光金胺O染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；KS-S100全自動染色機用革蘭染色液、萋-尼抗酸染色液、熒光金胺O染色液均采用儀器配套染色液。KS-S100全自動染色機由北京東方日創(chuàng)生物科技有限公司提供用于評估實驗；普通光學(xué)顯微鏡購自德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，熒光顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司。

二、方法

1.標(biāo)本涂片：痰標(biāo)本、便標(biāo)本直接用無菌棉簽取適量涂玻片，干燥固定。胸腹腔積液標(biāo)本、腦脊液標(biāo)本采用細(xì)胞離心涂片機離心制片，干燥固定。純培養(yǎng)菌落涂片取適量菌體，用1滴生理鹽水研磨涂布于玻片上，干燥固定。所有標(biāo)本均制片≥2張用于手工法和KS-S100儀器法兩種染色手段的平行處理。制好的涂片在生物安全柜中紫外線照射1 h。

2.染色：手工法革蘭染色、萋-尼抗酸染色、熒光抗酸染色操作流程完全參照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行[5-6]。KS-S100全自動染色機革蘭染色、萋尼法抗酸染色、熒光法抗酸染色操作完全按照廠家指導(dǎo)說明進(jìn)行。

3.鏡檢及結(jié)果判定：革蘭染色和萋-尼抗酸染色標(biāo)本在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。對于革蘭染色，革蘭陽性細(xì)菌呈紫色，革蘭陰性細(xì)菌呈粉紅色，酵母菌呈紫色。對于萋-尼抗酸染色，抗酸陽性細(xì)菌呈粉紅色，抗酸陰性細(xì)菌呈藍(lán)色。熒光抗酸染色標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察陽性熒光信號。對于生物標(biāo)本染色，背景細(xì)胞著色清晰、細(xì)菌染色特征典型、染料雜質(zhì)少判斷為染色合格；背景細(xì)胞著色模糊、細(xì)菌染色特征不易辨認(rèn)、染料雜質(zhì)多判斷為染色不合格[7]。以手工法染色結(jié)果作為參考，對于染色結(jié)果不一致的樣本再次以手工法染色進(jìn)行復(fù)核驗證，計算2種染色方法染色結(jié)果的一致率(染色結(jié)果一致的樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100%)；并從染色效率、易操作性及安全性等方面進(jìn)一步評估全自動智能染色機的染色性能。

結(jié) 果

一、染色效果

全自動智能染色機在不同類型臨床微生物標(biāo)本染色方面總體效果好，菌體著色清晰，染色特征易辨認(rèn)，無染料雜質(zhì)沉積等情況(圖1～12)。

二、一致性比較

1.革蘭染色：全自動智能染色機在不同類型臨床微生物標(biāo)本的革蘭染色方面總體效果好，與手工法革蘭染色結(jié)果一致(表1)。

2.萋-尼抗酸染色：全自動智能染色機在分枝桿菌萋-尼抗酸染色方面與手工法染色結(jié)果一致(表2)。

3.熒光抗酸染色：全自動智能染色機在分枝桿菌熒光抗酸染色方面與手工染色的結(jié)果一致(表3)。

三、染色性能評估

全自動智能染色機對臨床微生物標(biāo)本的染色效果好，與手工法染色結(jié)果一致。并且，全自動智能染色機在染色效率、易操作性、穩(wěn)定性和安全性等方面均明顯優(yōu)于手工法(表4)。

表1 全自動智能染色機與手工法染色結(jié)果比對

續(xù)表1

圖1 全自動智能染色機對痰標(biāo)本的革蘭染色效果圖，可見革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌和革蘭陽性桿菌 圖2 全自動智能染色機對血培養(yǎng)陽性液標(biāo)本的革蘭染色效果圖，可見革蘭陰性桿菌 圖3 全自動智能染色機對腹腔積液標(biāo)本的革蘭染色效果圖，可見革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌 圖4 全自動智能染色機對糞便標(biāo)本的革蘭染色效果圖，可見革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌，形態(tài)多樣 圖5 全自動智能染色機對革蘭陽性球菌純菌涂片效果(金黃色葡萄球菌) 圖6 全自動智能染色機對革蘭陰性球菌純菌涂片效果(卡他莫拉菌) 圖7 全自動智能染色機對革蘭陽性桿菌純菌涂片效果(紋帶棒桿菌) 圖8 全自動智能染色機對革蘭陰性桿菌純菌涂片效果(大腸埃希菌) 圖9,10 痰標(biāo)本萋尼法抗酸染色(分枝桿菌) 圖11,12 痰標(biāo)本熒光法抗酸染色(分枝桿菌)

表2 不同分枝桿菌標(biāo)本萋-尼抗酸染色手工法與全自動智能染色機染色法結(jié)果的比較

表3 不同分枝桿菌標(biāo)本熒光抗酸染色手工法與全自動智能染色機染色結(jié)果的比較

表4 手工法與全自動智能染色機染色性能的對比

討 論

微生物實驗室的傳統(tǒng)細(xì)菌染色技術(shù)是采用手工染色法依照具體步驟逐步完成，整個流程全部依靠手工操作，人員占用力度大；技術(shù)人員的操作手法、熟練程度等的差異易導(dǎo)致染色結(jié)果出現(xiàn)偏差，所以手工法染色結(jié)果重復(fù)性差，不易做到標(biāo)準(zhǔn)化，需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員進(jìn)行操作[7-8]。染色時間的長短嚴(yán)重影響染色結(jié)果[9]，標(biāo)本量過多容易導(dǎo)致每一步驟的操作時間超過規(guī)定的染色時間繼而影響染色效果，這使得手工染色法的染色通量受到一定的限制。此外，傳統(tǒng)手工法染色需要靠近水池進(jìn)行操作，染液易迸濺到周圍物品上造成污染；同時，手工法染色處于開放環(huán)境中，流水沖洗及吹吸染液過程中易形成氣溶膠危害。

相比之下，KS-S100全自動染色機無論是在操作簡易程度上，還是染色效率上均較手工染色法具有優(yōu)勢。操作人員只需將制好的待染色玻片放入染色機中，選擇好目標(biāo)程序后即可通過自動化操作完成整個染色過程，人員活動自由，染色結(jié)束后取出已干燥的玻片直接鏡檢即可。KS-S100全自動染色機采用高通量設(shè)計，一個染色流程可處理40張待染色涂片，明顯優(yōu)于手工法染色通量；并且隨著標(biāo)本量的增加，全自動染色系統(tǒng)相比手工染色消耗的時間明顯減少，高通量優(yōu)勢更為明顯。自動染色機對操作人員的占用力度小，技術(shù)員可在儀器染色過程中進(jìn)行鏡檢閱片等工作，在節(jié)省了操作人員人力消耗的同時，又將鏡檢結(jié)果報告時間提前，對后續(xù)檢驗工作和指導(dǎo)臨床診斷及治療等方面具有重要意義。在當(dāng)前強調(diào)規(guī)范化操作、質(zhì)量控制嚴(yán)格的環(huán)境下，如何做好標(biāo)準(zhǔn)化操作是各級實驗室必須關(guān)注的。KS-S100全自動染色機操作不受人為因素影響，能夠保證染色結(jié)果的穩(wěn)定性，便于染色實驗的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化管理。此外，KS-S100自動染色機的系統(tǒng)呈封閉狀態(tài)，染色過程中產(chǎn)生的所有廢液都可以集中回收，不會造成染液遺灑和噴濺，從而提高了生物安全性及工作環(huán)境的整潔度。

本研究所涉及的微生物標(biāo)本類型涵蓋了臨床常見的染色檢查樣本及菌株種類，能夠有效地評價全自動智能染色機在臨床微生物檢驗中的應(yīng)用。該染色機在臨床標(biāo)本革蘭染色、萋-尼抗酸染色和熒光抗酸染色方面的染色合格率高，與手工法染色結(jié)果一致，且在染色效率、易操作性、穩(wěn)定性及安全性等方面均較傳統(tǒng)手工染色具有明顯優(yōu)勢。本研究表明，全自動智能染色機在臨床微生物標(biāo)本革蘭染色、萋-尼抗酸染色、熒光抗酸染色方面染色性能良好，在提供高質(zhì)量染色結(jié)果的同時，提高染色效率，減少人力占用，能滿足臨床微生物標(biāo)本染色的需求。

[1] 王瑤, 徐英春, 謝秀麗, 等. 全自動微生物鑒定藥敏分析儀對臨床相關(guān)細(xì)菌藥敏測定能力的評估. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 30(9):1052-1055.

[2] 趙忠, 楊秀蓮, 張德明. Phoenix-100全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)的臨床應(yīng)用. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 29(8): 751-752.

[3] 張麗, 徐英春. MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室的應(yīng)用研究進(jìn)展. 中國感染與化療雜志, 2013, 13(3): 226-231.

[4] Popescu A, Doyle RJ. The Gram stain after more than a century. Biotech Histochem, 1996, 71(3): 145-151.

[5] 張秀明, 蘭海麗, 盧蘭芬. 臨床微生物檢驗質(zhì)量管理與標(biāo)準(zhǔn)操作程序. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2010: 317-323.

[6] 中國防癆協(xié)會. 結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程. 中國防癆雜志, 1996,18(1):28-29.

[7] 黎敏, 張峰領(lǐng), 王浚霽, 等. 全自動革蘭染色儀應(yīng)用效果評價. 重慶醫(yī)學(xué), 2013, 42(36): 4445-4446.

[8] 黃靜芳. 革蘭染色影響因素的探討. 實用醫(yī)技雜志, 2006, 13(18): 3312-3313.

[9] 何建民. 淺談細(xì)菌革蘭染色的影響因素. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2003, 26(1):62.

(本文編輯：李敬文)

Evaluation of the performance of automatic stainer in clinical microbiological samples staining

LIYing,CHENXin-xin,ZHAOYing,LIUYa-li,WANGHe,ZHANGXiao-jiang,YANGQi-wen,XUYing-chun.

DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUnionMedicalCollegeHospital,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China

Correspondingauthor:YANGQi-wen,Email:yangqiwen81@163.com

Objective To evaluate the performance of automatic stainer in staining of clinical microbiological samples. Methods One hundred and three microbiological samples collected from clinical patients were disposed to staining according to detailed needs of gram staining, acid-fast staining or fluorescence auramine O staining. The manual staining and the automatic stainer methods were carried out paralleled. Consistency of the staining results, efficiency, operability, stability and bio-safety of these two approaches were compared to evaluate the performance of automatic stainer. Results The automatic stainer performed excellently in clinical microbiological samples staining with higher consistency to manual staining results on gram staining (100% (58/58)), acid-fast staining (100% (45/45)) and fluorescent staining (100% (45/45)) and merits of being efficient, easy to operate, stable and pollution-free. Conclusion The automatic stainer had favorable performance in staining of clinical microbiological samples.

Clinical laboratory techniques; Staining and labeling; Mycobacterium; Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.011

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新團隊項目(2016-I2M-3-014)

100730 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科

注：李穎和陳欣欣對本文有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者

楊啟文，Email:yangqiwen81@163.com

2016-10-17)