陳宣男，陳前龍，全首禎

Ring-Box 1基因負(fù)調(diào)控抗病毒天然免疫的初步研究

陳宣男，陳前龍，全首禎

目的研究Ring-Box 1基因（RBX1/ROC1）對視黃酸誘導(dǎo)基因-I（retinoic acid inducible gene I, DDX58/RIG-I）抗病毒感染信號通路功能的影響，尋找抗病毒治療的潛在靶標(biāo)。方法利用PCR擴(kuò)增RBX1/ROC1基因，將其插入pCDNA3載體，并且通過免疫印跡檢測質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)；利用熒光素酶報告基因檢測RBX1/ROC1基因?qū)DX58/RIG-I信號通路的影響。結(jié)果本研究成功構(gòu)建Flag-RBXI/ROC1真核表達(dá)載體并在HEK293細(xì)胞中得到了表達(dá)；通過熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)RBX1/ROC1基因抑制DDX58/RIG-I信號通路。結(jié)論RBX1/ROC1是宿主天然免疫DDX58/RIG-I抗病毒感染信號通路的負(fù)調(diào)控分子，為尋找抗病毒靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

RBX1/ROC1基因；DDX58/RIG-I信號通路；負(fù)調(diào)控

目前，抗病毒感染藥物的靶標(biāo)主要針對病毒自身的特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計，但是隨著耐藥及新發(fā)傳染病的出現(xiàn)，以宿主蛋白為靶點(diǎn)的抗病毒策略應(yīng)運(yùn)而生。該策略基于對病毒與宿主相互作用的了解。宿主天然免疫是宿主抗感染的第一道防線，是比較明確的廣譜抗病毒感染的途徑[1-2]。宿主表達(dá)的模式識別受體識別病原微生物的模式相關(guān)模體，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活宿主的炎癥及I型干擾素信號通路。位于細(xì)胞漿中的視黃酸誘導(dǎo)基因-I（retinoic acid inducible gene I, DDX58/RIG-I）主要識別病毒RNA，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終通過NF-κB和IRF3等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎癥相關(guān)分子的細(xì)胞因子和I型干擾素的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要的抗病毒作用，同時有些蛋白參與天然免疫信號通路負(fù)調(diào)控，而降低這些負(fù)調(diào)控分子可能成為抗病毒感染新策略[3]。

RBX1/ROC1基因最初被報道與胚胎發(fā)育相關(guān)，RBX1/ROC1基因表達(dá)異常導(dǎo)致SCF連接酶復(fù)合物活性損失，進(jìn)而引起胚胎損傷[4]。近期的研究表明RBX1/ROC1基因在腫瘤中高表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。但是，RBX1/ROC1在宿主天然免疫DDX58/RIG-I中的作用未見報道。本研究中，首先克隆并表達(dá)了該基因，進(jìn)而通過熒光素酶報告基因檢測了RBX1/ROC1負(fù)調(diào)控DDX58/RIG-I信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎HEK293細(xì)胞和pCDNA3-Flag質(zhì)粒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、膠回收試劑盒、Trizol、2×PFU PCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；BamHⅠ、XhoⅠ等限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA快速T4連接酶為全世金公司產(chǎn)品。引物合成、測序由奧科公司完成；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；Flag抗體購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；Dual-Lucifersae reporter Assay 試劑盒購自Promega公司。

1.2 Flag-ROC1質(zhì)粒構(gòu)建 提取HEK293細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后作為PCR模板。按照RBX1/ ROC1基因的DNA序列，設(shè)計PCR引物序列如下，上游引物RBX1/ROC1-BamH I-F：GG GGATCC ATGGCGGCAGCGATGG，下游引物RBX1/ROC1-Xho I-R：GG CTCGAG CTAGTGCCCATACTTTTGGAATTC。PCR反應(yīng)體系為（50 μl）：模板5 μl，上、下游引物各0.5 μl，2×PFU PCR Mix 25 μl及ddH2O 19 μl。PCR程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30個循環(huán)；72 ℃3 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥债a(chǎn)物和pCDNA3-Flag質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，37 ℃過夜后，分別進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定及回收。T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。涂氨芐青霉素平板后，挑取單克隆擴(kuò)增，進(jìn)行菌液PCR和質(zhì)粒酶切鑒定，將鑒定正確的克隆送奧科公司進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為Flag-ROC1。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和免疫印跡 將質(zhì)粒按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。24 h后收取細(xì)胞，用NP-40細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，15 min后，4 ℃離心10 min，取上清與上樣緩沖液混合。配制15% SDS-PAGE膠，進(jìn)行樣品的電泳分離。電泳后，半干轉(zhuǎn)（Bio-Rad）18 V，1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fl uoride, PVDF）膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h； 5% 脫脂奶粉配制的一抗室溫孵育1 h，TBST洗脫3次；加入5% 脫脂奶粉配制的二抗室溫孵育1 h；TBST洗脫3次后，加入發(fā)光液，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光儀（天能公司）檢測并記錄。

1.4 熒光素酶報告基因活性分析 HEK293細(xì)胞接種于12孔板中，將質(zhì)粒按圖3和4所示共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。18 h后細(xì)胞用1×PBS洗2次，在每孔中加入100 μl 1×被動裂解（Promega公司試劑盒），室溫裂解15 min，取上清50 μl進(jìn)行熒光素酶活性測定。檢測按照Promega公司試劑盒所述方法進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1 Flag-ROC1質(zhì)粒的構(gòu)建 本研究提取了HEK293細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RBX1/ROC1為327 bp，擴(kuò)增得到的片段大小與預(yù)期相符（圖1A）。將擴(kuò)增的RBX1/ROC1純化、酶切后連入pCDNA3-Flag，構(gòu)建了RBX1/ROC1表達(dá)質(zhì)粒，命名為Flag-ROC1，通過酶切對插入序列進(jìn)行了鑒定，片段大小與預(yù)期相符（預(yù)期約為327 bp）（圖1B）。測序通過Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）比對證明插入序列正確（圖1C）。

圖1 RBX1/ROC1擴(kuò)增與pCDNA3-Flag-ROC1質(zhì)粒酶切鑒定A. PCR擴(kuò)增RBX1/ROC1；B. pCDNA3-Flag-ROC1質(zhì)粒BamHⅠ+ XhoⅠ雙酶切鑒定；C. pCDNA3-Flag-ROC1測序結(jié)果序列比對Figure 1 RBX1/ROC1 gene amplification by PCR and cloning into pCDNA3-Flag plasmid

2.2 Flag-ROC1質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 將Flag空載體和Flag-ROC1 1 μg分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，然后行免疫印跡，檢測Flag-ROC1的表達(dá)，根據(jù)Genecard數(shù)據(jù)庫給出的理論分子量，F(xiàn)lag-ROC1的分子量約為12 kDa，本研究結(jié)果顯示Flag-ROC1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞低于15 kDa處可見陽性條帶，而Flag空載體未見條帶（圖2），Tubulin為上樣對照。

圖2 Flag-ROC1在HEK293細(xì)胞的表達(dá)1. HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-空載體；2. HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-ROC1Figure 2 Expression of Flag-ROC1 in HEK293 cells

2.3 Flag-ROC1抑制DDX58/RIG-I引起的干擾素激活 DDX58/RIG-I的2CARD 結(jié)構(gòu)域可以激活干擾素表達(dá)，將DDX58/RIG-1-2CARD、IFN-β-Luc、pRL及不同量的Flag-ROC1轉(zhuǎn)染入HEK293中，從圖3A可以看到RIG-I-2CARD（100 ng）可以激活I(lǐng)FN-β報告基因，而RBX1/ROC1可以抑制這一作用，分別抑制了44.8%，58.7%及80.0%，可以看到隨著RBX1/ROC1量增加，抑制作用增強(qiáng)。分泌到細(xì)胞外的IFN-β通過與其受體結(jié)合，進(jìn)一步通過JAKSTAT途徑激活I(lǐng)FN誘導(dǎo)基因（interferon stimulate response element, ISRE），因此我們通過熒光素酶活性進(jìn)一步檢測了RBX1/ROC1對DDX58/RIG-I激活的信號通路的影響，與IFN-β報告基因結(jié)果相符，RBX1/ROC1可以抑制ISRE報告基因的激活，抑制率分別為38.2%，58.1%及77.5%（圖3B）。

2.4 Flag-ROC1抑制polyI∶C引起的干擾素激活 polyI∶C是雙鏈DNA的擬似物，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后可以激活內(nèi)源的DDX58/RIG-I信號通路。從圖4A可以看到RBX1/ROC1呈劑量依賴性的抑制polyI∶C（100 ng）對IFN-β的激活（抑制率分別為43.6%，63.0%及72.7%），同樣也可以抑制ISRE報告基因的激活（抑制率分別為38.37%，55.28%及71.7%）（圖4B）。

圖3 過表達(dá)RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I的激活A(yù). 轉(zhuǎn)染不同劑量的RBX1/ROC1，檢測DDX58/RIG-I激活的干擾素報告基因活性；B. 轉(zhuǎn)染不同劑量的RBX1/ROC1，檢測DDX58/ RIG-I激活的干擾素誘導(dǎo)報告基因活性Figure 3 Inhibitory role of RBX1/ROC1 on DDX58/RIG-I signaling pathway

3 討 論

SCF E3連接酶復(fù)合物是重要的RING指型泛素連接酶家族，該復(fù)合物包含多個亞基。SCF復(fù)合物包含三種固定成分RBX1/ROC1（RING-指蛋白）、Cullin蛋白、接頭蛋白以及可變組份F-盒蛋白（F-box）（與特異底物結(jié)合）。SCF E3連接酶復(fù)合物的底物包括細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、DNA損傷修復(fù)基因、抑癌基因等[7-10]，參與癌癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)RBX1/ROC1基因在胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤中呈高表達(dá)。而抑制RBX1/ ROC1的表達(dá)，可以抑制腫瘤發(fā)展，因此RBX1/ ROC1可以作為腫瘤治療的靶標(biāo)[5,11]，RBX1/ROC1在DDX58/RIG-I引起的宿主天然免疫的功能尚未見報道。我們的研究初步發(fā)現(xiàn)了RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I通路激活的I型干擾素產(chǎn)生，但是RBX1/ROC1是否通過SCF E3連接酶復(fù)合物發(fā)揮作用及參與該復(fù)合物的其他分子有待進(jìn)一步研究。

DDX58/RIG-I是識別RNA病毒感染的重要分子，DDX58/RIG-I在平時處于抑制狀態(tài)，當(dāng)其與底物結(jié)合后，暴露其CARD結(jié)構(gòu)域，通過CARDCARD相互作用，將信號傳導(dǎo)給位MAVS，MAVS在線粒體上形成大的聚合物，募集TRAF3和TRAF6，進(jìn)一步激活蛋白激酶TBK1和IKK復(fù)合物，促進(jìn)NF-κB和IRF3等轉(zhuǎn)錄因子入核，促進(jìn)炎癥相關(guān)分子的細(xì)胞因子和I型干擾素的轉(zhuǎn)錄[12]。研究發(fā)現(xiàn)了RBX1/ROC1抑制DDX58/RIG-I通路，但是靶向DDX58/RIG-I通路中的哪個重要蛋白，仍須要進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)RBX1/ROC1是宿主天然免疫的DDX58/RIG-I信號通路負(fù)調(diào)控分子，為進(jìn)一步揭示RBX1/ROC1調(diào)控宿主天然免疫的機(jī)制打下基礎(chǔ)，并且為抗病毒和抗炎治療提供了潛在的靶標(biāo)。

圖4 過表達(dá)RBX1/ROC1抑制polyI:C激活的干擾素途徑A. 轉(zhuǎn)染不同劑量的RBX1/ROC1，檢測polyI:C激活的干擾素報告基因活性；B. 轉(zhuǎn)染不同劑量的RBX1/ROC1，檢測polyI:C激活的干擾素誘導(dǎo)報告基因活性Figure 4 The inhibitory role of RBX1/ROC1 on polyI:C induced signaling pathway

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（2017-03-02收稿 2017-04-01修回）

（本文編輯 胡 玫）

Ring-Box 1 gene negatively regulates anti-viral innate immune response

CHEN Xuan-nan*, CHEN Qian-long, QUAN Shou-zhen
Party Committee Office of Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100037, China

ObjectiveTo study the role of Ring-Box 1 (RBX1/ROC1) in regulating retinoic acid-inducible gene I (DDX58/RIG-I) mediated anti-viral signaling pathway and explore the potential therapeutic target.MethodsThe full-length RBX1/ROC1 gene was amplified by PCR and inserted it in pCDNA3 plasmid. And then, the over-expression of RBX1/ROC1 in HEK293 cells was detected by Western Blot. Finally, the regulatory role of RBX1/ROC1 on DDX58/RIG-I was detected by luciferase reporter assays.ResultsFlag-ROC1 eukaryotic expression plasmid was constracted. After transfected it into the HEK293 cells, Flag-ROC1 was expressed in these cells. We further found that RBX1/ROC1 downregulated DDX58/RIG-I signaling pathway by luciferase reporter assays.ConclusionsRBX1/ROC1 is a negative regulator of DDX58/RIG-I anti-viral signaling pathway and our study provides a potential therapeutic target of anti-viral.

RBX1/ROC1; DDX58/RIG-I; negative regulated

R392

A

1007-8134(2017)02-0091-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.02.006

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81470487）

100037 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院黨委辦公室（陳宣男），實(shí)驗(yàn)診斷中心（陳前龍）；100142 北京，解放軍空軍總醫(yī)院（全首禎）

陳宣男，E-mail: fuwaichenxuannnan@126.com

*Corresponding author, E-mail: fuwaichenxuannan@126.com