龔范勇 葛盈盈 肖紹文*

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西高?；A(chǔ)醫(yī)學重點實驗室，南寧市 530021)

·論 著·

實時熒光定量PCR檢測人腦膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤中SAMD14的表達▲

龔范勇1葛盈盈2肖紹文1*

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西高?；A(chǔ)醫(yī)學重點實驗室，南寧市 530021)

目的 分析人膠質(zhì)瘤和髓母細胞瘤中SAMD 14 mRNA的表達情況及其與臨床參數(shù)間的關(guān)系。方法 使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測10例正常人腦組織、24例膠質(zhì)瘤患者和11例髓母細胞瘤患者腫瘤組織中SAMD 14 mRNA的相對表達量，分析其表達與患者臨床病理學特征的關(guān)系。結(jié)果 膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤組織中SAMD 14 mRNA的表達水平低于正常腦組織，膠質(zhì)瘤中SAMD 14 mRNA的表達水平高于髓母細胞瘤組織(P<0.05)。SAMD 14 mRNA相對表達量與性別、年齡、腫瘤直徑和KPS評分等因素無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 SAMD 14 mRNA的低表達可能與膠質(zhì)瘤和髓母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

膠質(zhì)瘤；髓母細胞瘤；SAMD 14；熒光定量PCR

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡稱膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)細胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的最新分類系統(tǒng)，膠質(zhì)瘤被分為Ⅰ～Ⅳ四個等級，其中Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤惡性度較高，患者平均存活時間僅為1年左右[1]。髓母細胞瘤是一種常見的兒童顱內(nèi)腫瘤，偶發(fā)于成年人，為WHO IV級高惡性腫瘤。目前，在臨床上針對膠質(zhì)瘤及髓母細胞瘤的治療主要以外科手術(shù)切除為主，術(shù)后結(jié)合放療、化療等輔助手段，但效果欠佳，特別是Ⅲ～Ⅳ級高惡性腫瘤患者的預(yù)后不理想。近年來，隨著分子遺傳學、分子生物學的發(fā)展，針對膠質(zhì)瘤的診斷、鑒別診斷和靶向治療分子標記物的研究取得較大進展，IDH1、MGMT等各類標記物被大量用于腦腫瘤的臨床研究以及相關(guān)臨床試驗[2-3]。

SAMD 14(sterile alpha motif domain containing 14)為近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于17q 21.33染色體上。SAMD 14編碼蛋白由417個氨基酸組成。有報道顯示，SAMD 14在肺癌中有抑癌作用[4]，并參與血液系統(tǒng)造血功能調(diào)控[5]，其余功能尚不清楚。目前為止，SAMD 14在腦腫瘤中的功能尚無文獻報道。本實驗主要從基因水平上研究SAMD 14在成人膠質(zhì)瘤組織和成人髓母細胞瘤組織的表達情況，探討SAMD 14作為腫瘤分子標記物的可能及SAMD 14表達情況與膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤臨床參數(shù)間的關(guān)系，為進一步開展針對SAMD 14的分子作用機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科一病區(qū)2009年1月至2010年12月住院治療的45例經(jīng)開顱手術(shù)切除的腦腫瘤組織和正常組織，診斷均經(jīng)病理學確診。其中正常腦組織10例，男6例，女4例；腦腫瘤組織35例，男22例，女13例。腦腫瘤組織病例年齡18～76(39.26±14.85)歲。按2007年第4版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》，其中Ⅰ～Ⅱ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤12例，Ⅲ～Ⅳ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤12例，Ⅲ～Ⅳ級髓母細胞瘤11例。腦腫瘤組織均取自原發(fā)灶，獲得標本后立即放入去RNA酶和DNA酶的1.5 mL EP管中，置于液氮暫時保存，隨后立即轉(zhuǎn)至-80℃冰箱低溫保存。所有病例均全切腫瘤，術(shù)前均未行放療和化療。本實驗經(jīng)過廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 LightCycler480II熒光定量PCR儀(上海羅氏制藥有限公司)，OSE-260超微量分光光度計(北京天根生化科技有限公司)，5810R臺式多功能冷凍高速離心機(德國Eppndorf公司)，-80℃超低溫冰箱(海爾公司)，高速分散均質(zhì)機(上海標本模型廠)；Takara 總RNA提取試劑盒購自南寧科迪生物技術(shù)有限公司，總RNA抽提試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；LightCycler480 SYBR Green I Masster熒光定量PCR試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 參照文獻[1]，并根據(jù)Genebank中人類SAMD 14、GAPDH基因的cDNA序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5設(shè)計引物，引物由上海英濰捷基有限公司合成。SAMD 14引物序列：上游5′-AGACGCTGAAGATGACCGATG-3′，下游5′- ACGGGTTCTCGGAGCTTTG-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 實驗方法 取50～60 mg組織標本于1 mL總RNA抽提試劑中，使用高速分散均質(zhì)機打碎組織，隨后依照RNA提取試劑盒說明書提取組織中總RNA，用超微量分光光度計檢測濃度，并測量樣品在260 nm和280 nm下的吸光光度，計算D260/D280，所有標本的比值均在1.8～2.0之間。檢測RNA濃度及純度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，在LightCycler480II熒光定量PCR儀上進行檢測。擴增體系20 μL：SYBR Green I Masster 10 μL，上下游引物各2 μL，RNA-free H2O 6.8 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃10 s，退火60℃ 10 s，延伸72℃ 10 s，共計45個循環(huán)。每個樣本均設(shè)置3個副孔。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用 △△CT法進行處理，計算各樣本△CT 值，以2-△△Ct值來表示腫瘤組織目的基因表達量相對正常組織目的基因表達量的相對倍數(shù)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料采用(x±s)表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。臨床參數(shù)分析采用t檢驗和秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SAMD 14mRNA在正常腦組織和腫瘤中的表達情況 定量PCR結(jié)果如圖1。SAMD 14 mRNA在正常腦組織中的相對表達量高于腫瘤組織中的相對表達量，平均約為所有膠質(zhì)瘤組織相對表達量的3.2倍、WHO Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織相對表達量的2.6倍、WHO Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織相對表達量的4.1倍和髓母細胞瘤的11.2倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，SAMD 14 mRNA在膠質(zhì)瘤組織中的相對表達量亦高于其在髓母細胞瘤組織中的相對表達量，均值約為髓母細胞瘤組織相對表達量的3.5倍。并且SAMD 14 mRNA在WHO Ⅰ～Ⅱ級和WHO Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的相對表達量均高于其在髓母細胞瘤組織中的相對表達量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，定量PCR結(jié)果顯示SAMD 14 mRNA在WHO Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織的相對表達量高于其在WHO Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織相對表達量，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

圖1 實時熒光定量PCR熔解峰

圖2 實時熒光定量PCR檢測各組織中SAMD 14 mRNA的表達

注：A：SAMD 14 mRNA在正常腦和腫瘤組織中表達情況比較；B：SAMD 14 mRNA在正常腦和不同分級膠質(zhì)瘤組織中表達情況比較；C：SAMD 14 mRNA在髓母細胞瘤和膠質(zhì)瘤組織中表達情況比較；D：SAMD 14 mRNA在髓母細胞瘤和不同分級膠質(zhì)瘤組織中表達情況比較；E：SAMD 14 mRNA在不同分級膠質(zhì)瘤組織中表達情況比較。

2.2 SAMD 14 mRNA的表達與臨床參數(shù)的關(guān)系 在所納入膠質(zhì)瘤病例及髓母細胞瘤病例中，SAMD 14 mRNA相對表達量與患者的性別、年齡、腫瘤直徑和KPS評分等因素均無關(guān)(P>0.05)。見表1、表2。

表1SAMD 14 mRNA的表達和膠質(zhì)瘤臨床特征的關(guān)系

表2 SAMD 14 mRNA的表達和髓母細胞瘤臨床特征的關(guān)系

3 討 論

隨著分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展，目前認為膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤的發(fā)生包括了細胞周期調(diào)控、細胞信號傳導、細胞分化等多種機制的相互作用，涉及多個突變基因的積累、原癌基因的激活、抑癌基因的失活。因此，對腫瘤臨床診斷治療相關(guān)分子標記物的篩選愈來愈重要。

本實驗結(jié)果顯示：在mRNA水平，SAMD 14在膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤中的相對表達量低于在正常腦中的相對表達量。同時在髓母細胞瘤中SAMD 14相對表達量低于膠質(zhì)瘤。對膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤病例進行分級比較后發(fā)現(xiàn)，SAMD 14 mRNA表達水平與患者年齡、性別、腫瘤大小等均不相關(guān)。并且，在膠質(zhì)瘤中，隨著WHO分級惡性程度提高，SAMD 14表達有下降趨勢，提示SAMD 14受抑制可能與膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤的發(fā)生有關(guān)，SAMD 14的受抑制可能增強腫瘤的侵襲，增加腫瘤復(fù)發(fā)風險，表明SAMD 14有作為膠質(zhì)瘤分化程度指標的潛力。

作為一種抑癌基因，SAMD 14位于17q 21.33染色體上，其編碼蛋白含有一種特殊的蛋白結(jié)構(gòu)域—SAM域[6]，該結(jié)構(gòu)域約含有70余個氨基酸殘基，是一個具有較高進化保守性的蛋白結(jié)構(gòu)域，在真核細胞胞質(zhì)、胞核及胞膜廣泛分布，參與細胞發(fā)育等多種細胞功能調(diào)控。SAM域可以通過與多種蛋白、RNA相結(jié)合，在多種分子通路中發(fā)揮作用。比如， Tankyrase-1 (TNKS 1)中的SAM域突變會阻礙TNKS 1與Axin 1等其他信號因子結(jié)合，進而抑制TNSK1參與調(diào)控WNT信號通路[7]；神經(jīng)節(jié)苷脂GM 1可與P 63上的SAM域相結(jié)合，調(diào)控人表皮細胞分化[8]。

在肺癌組織中SAMD 14 mRNA相對表達量低于在對應(yīng)癌旁組織和其他正常肺組織的相對表達量，并且在A 549、Calu-3等肺癌細胞系中SAMD 14 mRNA相對表達量亦明顯下調(diào)。由于SAMD 14啟動子區(qū)有約70%CG含量，因此Sun等[4]針對肺癌患者腫瘤-瘤旁組織標本、肺癌細胞系等不同樣本的這一特殊區(qū)域進行了亞硫酸氫鹽處理后測序和甲基化特異性PCR實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于瘤旁組織及正常肺組織，SAMD 14啟動子區(qū)在肺癌組織和肺癌細胞系樣本中有明顯的異常高甲基化。所以，SAMD 14在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用很可能與其啟動子區(qū)的異常甲基化有關(guān)—SAMD 14啟動子區(qū)異常甲基化導致SAMD 14表達下調(diào)，從而使它的抑癌功能無法正常發(fā)揮。Shen等的研究也證實這一現(xiàn)象[9]。而近年對膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤的表觀遺傳學研究也發(fā)現(xiàn)，MGMT、BATF 2等部分腫瘤相關(guān)基因參與腫瘤形成的機制與他們啟動子區(qū)異常甲基化有關(guān)，這些基因的不同甲基化程度也可以配合磁共振等影像學檢查，其結(jié)果在一定程度上揭示不同患者預(yù)后情況[10-12]。因此，SAMD 14在膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤中的功能抑制有可能與其啟動子區(qū)異常甲基化有關(guān)，具體機制還有待進一步研究。

綜上所述， SAMD 14 mRNA表達受抑制對膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的影響和促進作用。SAMD 14有作為反映膠質(zhì)瘤惡性程度標記物的潛力，為腫瘤治療的研究提供了新的思路和靶點。由于腫瘤發(fā)生為涉及多種機制、多種基因相互作用的結(jié)果，SAMD 14在膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤的具體機制還有待進一步研究。

[1] 王 雷,劉艷波,王振江,等. IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中表達的研究[J].天津醫(yī)藥,2016,44(8):1018-1021.

[2] Alcantara Llaguno SR，Parada LF. Cell of origin of glioma:bilogical and clinical implications[J]. Br j Cancer,2016,115(12):1445-1450.

[3] Dutoit V,Migliorini D,Dietrich PY,et al. Immunotherapy of Malignant Tumors in the Brain: How Different from Other Sites?[J]. Front Oncol,2016,6:256.

[4] Sun W,Iijima T,Kano J,et al. Frequent aberrant methylation of the promoter region of sterile alpha motif domain 14 in pulmonary adenocarcinoma[J]. Cancer sci,2008,99(11):2177-2184.

[5] Hewitt KJ,Kim DH,Devadas P,et al. Hematopoietic Signaling Mechanism Revealed from a Stem/Progenitor Cell Cistrome[J]. Mol Cell,2015,59(1):62-74.

[6] Stapleton D,Balan I,Pawson T,et al. The crystal structure of an Eph receptor SAM domain reveals a mechanism for modular dimerization[J]. Nat Struct Biol,1999,6(1):44-49.

[7] Riccio AA,McCauley M,Langelier MF,et al. Tankyrase Sterile a Motif Domain Polymerization Is Required for Its Role in Wnt Signaling[J]. Structure,2016,24(9):1573-1581.

[8] Rufini S,Lena AM,Cadot B,et al. The sterile alpha-motif (SAM) domain of p63 binds in vitro monoasialoganglioside (GM1) micelles[J]. Biochem Pharmacol,2011,82(10):1262-1268.

[9] Shen Y,Takahashi M,Byun HM,et al. Boswellic acid induces epigenetic alterations by modulating DNA methylation in colorectal cancer cells[J]. Cancer Biol Ther,2012,13(7):542-552.

[10]Andrade AF,Borges KS,Suazo VK,et al. The DNA methyltransferase inhibitor zebularine exerts antitumor effects and reveals BATF2 as a poor prognostic marker for childhood medulloblastoma[J]. Invest New Drugs,2017,35(1):26-36.

[11]Roszkowski K,Furtak J,Zurawski B,et al. Potential Role of Methylation Marker in Glioma Supporting Clinical Decisions[J]. Int J Mol Sci,2016,17(11):E1876.

[12]Lopci E,Riva M,Olivari L,et al. Prognostic value of molecular and imaging biomarkers in patients with supratentorial glioma[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging,2017,Jan 21[Epllb ahead of print Ⅰ].

Expression of SAMD14 in human glioma and medulloblastoma detected by quantitative real time PCR

GONGFanyong1,GEYingying2,XIAOShaowen1*

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning,Guangxi530021，China; 2SchoolofBasicMedicalSciences,GuangxiMedicalUniversity.GuangxiKeyLaboratoryofBasicMedicalSciences,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To analyze the expression of SAMD 14 mRNA in human glioma and medulloblastoma，and to study their association with clinical features of glioma and medulloblastoma. Methods The expression of SAMD 14 mRNA was detected in 10 human normal brain tissues, 24 glioma tissues and 11 medulloblastoma tissues by qRT-PCR, then the relationship of their expression and clinical features were analyzed. Results The expression of SAMD 14 mRNA was lower in glioma and medulloblastoma tissues than in human normal brain tissues. The expression of SMAD14 mRNA was higher in glioma tissues than in medulloblastoma tissues(P<0.05). There is no significant difference between the expression of SMAD14 mRNA and clinical features(Sex, age, tumor diameter and KPS scores,etc). Conclusion The low expression of SAMD 14 were possibly related to tumorigenesis of glioma and medulloblastoma.

Glioma; Medulloblastoma;SAMD 14;qRT-PCR

國家自然科學基金(編號：81460382；81560408)；廣西自然科學基金(編號：2014GXNSFAA118231；2014GXNSFAA118089)；廣西醫(yī)科大學青年科學基金(編號：GXMUYSF201409)

R 739.41

A

1673-6575(2017)02-0162-05

10.11864/j.issn.1673.2017.02.02

2016-12-18

2017-02-15)

*通信作者