周 雯 孫芳芳 杜楊梅 馬存發(fā) 朱陳曾 鄭 敏 任雪松 司 軍 宋洪元

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜中的表達(dá)

周 雯 孫芳芳 杜楊梅 馬存發(fā) 朱陳曾 鄭 敏 任雪松 司 軍 宋洪元*

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

分別用不同濃度（50、100、200 mg·L-1）的除草劑安全劑類似化合物乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜。結(jié)果顯示：乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理后，IN2-2啟動(dòng)子在芥菜根、葉、花器官的花萼、花瓣、雄蕊及花粉中表達(dá)，但不在胚珠中表達(dá)。100 mg·L-1乙酰苯胺以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺適合用于在芥菜中調(diào)控IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)，乙酰苯胺較2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)表達(dá)所需時(shí)間更短。高濃度的2-氯苯磺酰胺影響芥菜種子發(fā)芽及生長發(fā)育，并且明顯抑制IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)活性。4 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在幼苗葉片中表達(dá)，IN2-2啟動(dòng)子輕微受150 mmol·L-1NaCl脅迫表達(dá)，但不受重金屬Gu2+離子的誘導(dǎo)表達(dá)。

IN2-2啟動(dòng)子；乙酰苯胺；2-氯苯磺酰胺；芥菜；GUS表達(dá)

化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)是一種重要的人工調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，通過化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的去抑制、激活和失活，被用于育性調(diào)控、基因功能分析、無標(biāo)記植物轉(zhuǎn)化、DNA定點(diǎn)刪除和基因沉默等多方面的研究（Gatz，1997）。植物中較為常見的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包括四環(huán)素、糖皮質(zhì)激素、乙醇和銅離子等誘導(dǎo)系統(tǒng)（Picard et al.，1988；Gossen & Bujard，1992），通過特定轉(zhuǎn)錄因子/蛋白誘導(dǎo)基因表達(dá)，調(diào)控相對(duì)復(fù)雜（Zuo & Chua，2000）。鑒于部分誘導(dǎo)物可能會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用、對(duì)環(huán)境具有安全隱患以及性質(zhì)不穩(wěn)定而不適合在大田應(yīng)用。如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)需要tet操縱子（Gossen & Bujard，1992），因四環(huán)素本身是蛋白合成抑制劑，可能會(huì)影響植物蛋白合成（Zuo & Chua，2000）。Cu2+本身是植株生長所必需的微量元素，但施用濃度超出一定范圍時(shí)會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生毒害作用（Mett et al．，1993）。

除草劑安全劑（safener）又稱為解毒劑（antidote）或保護(hù)劑（protectant），是一類選擇性保護(hù)作物免受除草劑傷害而改進(jìn)雜草防除效果的化合物，通過誘導(dǎo)諸如GSTs和P450s類基因表達(dá)，增強(qiáng)植物防御和去毒能力（畢洪梅 等，2007）。谷胱甘肽軛合論認(rèn)為安全劑的基因活化作用誘導(dǎo)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）或其他代謝酶活性的產(chǎn)生而達(dá)到保護(hù)的效果（Lay & Casida，1976）。玉米GST-27基因表達(dá)受除草劑安全劑的誘導(dǎo)但不受激素、環(huán)境、生理變化的影響（Jepson et al．，1994）。玉米IN2-2基因受除草劑安全劑2-CBSU〔N-（aminocarbonyl）-2-chlorobenzenesulfonamide〕誘導(dǎo)表達(dá)，在各種脅迫處理下基本不表達(dá)（Hershey & Stoner，1991）。IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥分別用4種不同的除草劑安全劑誘導(dǎo)處理后發(fā)現(xiàn)，2-CBSU能誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在根、莖尖分生組織和排水孔中表達(dá)（de Veylder et al．，1997）。由于基于除草劑安全劑的誘導(dǎo)系統(tǒng)不需要特定轉(zhuǎn)錄因子的參與，相對(duì)其他化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)更為簡(jiǎn)單；且除草劑安全劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛（高家東 等，2013），開發(fā)基于除草劑安全劑誘導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用前景廣闊。先后有來自玉米的GST-27、IN2-1、IN2-2、IN2-5等除草劑安全劑誘導(dǎo)啟動(dòng)子分別在馬鈴薯、煙草、擬南芥、水稻、玉米中被用于基因表達(dá)調(diào)控（Robertson et al．，2000；袁媛 等，2004；Behringer et al．，2011）。在模式植物擬南芥中，4種不同的除草劑安全劑中僅2-CBSU能誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在根、莖尖分生組織和排水孔中表達(dá)，其他除草劑安全劑只能在根中誘導(dǎo)表達(dá)（de Veylder et al．，1997）；除草劑安全劑2-CBSU缺少市售標(biāo)準(zhǔn)品，多為實(shí)驗(yàn)室專門合成（袁媛 等，2004）；另外，受習(xí)慣上認(rèn)為單子葉植物和雙子葉植物具有啟動(dòng)子表達(dá)偏好性的影響，導(dǎo)致IN2-2啟動(dòng)子除了在模式植物擬南芥中的表達(dá)特點(diǎn)被報(bào)道外，缺少在其他雙子葉植物中的表達(dá)分析研究。

目前，IN2-2啟動(dòng)子已被成功用于單子葉植物玉米、水稻、小麥、甘蔗的基因表達(dá)調(diào)控（Choi et al．，2003；Cho et al．，2014），顯現(xiàn)其在植物基因表達(dá)調(diào)控中的巨大應(yīng)用價(jià)值。而早先在擬南芥中的IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)信息（缺少雌雄蕊、花粉、胚珠中的表達(dá)特性）尚不足以顯示該啟動(dòng)子在雙子葉植物中的可能應(yīng)用前景（de Veylder et al．，1997）。另外，在煙草中發(fā)現(xiàn)乙酰苯胺化合物可以誘導(dǎo)玉米類似啟動(dòng)子IN5-2的表達(dá)（馬亮 等，2010）；而2-氯苯磺酰胺在分子結(jié)構(gòu)上與除草劑安全劑2-CBSU相似。因此，本試驗(yàn)利用IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜植株，以35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜為對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因植株不同時(shí)期分別用不同濃度的乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺進(jìn)行誘導(dǎo)處理，比較IN2-2啟動(dòng)子對(duì)上述不同化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)響應(yīng)以及在芥菜各組織、器官中的表達(dá)特點(diǎn)；同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行4 ℃低溫、鹽脅迫以及Cu2+脅迫處理，觀察IN2-2啟動(dòng)子在不同脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。以期為今后在十字花科雙子葉植物中利用IN2-2啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)化學(xué)調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年4～8月在西南大學(xué)園藝園林學(xué)院蔬菜實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。利用常規(guī)品種渝豐榨菜獲得的IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因種子及35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜種子均由本院蔬菜實(shí)驗(yàn)室保存。誘導(dǎo)劑乙酰苯胺（Acetylaniline）和2-氯苯磺酰胺（2-Chlorobenzenesulfonamide）分別購自生工生物工程（上海）股份有限公司和重慶鼎國生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 轉(zhuǎn)基因芥菜處理

分別將乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺配制成濃度為50、100、200 mg·L-1的溶液，以野生型芥菜和35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜清水處理為對(duì)照。① 將IN2-2：：GUS芥菜種子分別置于添加不同濃度乙酰苯胺溶液、2-氯苯磺酰胺溶液的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，每處理10～12粒，3次重復(fù)，分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)各處理的種子發(fā)芽情況；25 ℃處理3 d后將萌發(fā)以及未萌發(fā)的種子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。② 分別用不同濃度乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺灌根處理苗齡45 d的IN2-2：：GUS幼苗，每處理3株，3次重復(fù)；分別在處理后0、2、5、7 d取部分側(cè)根和新生葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。③IN2-2：：GUS植株開花后，分別用不同濃度乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺溶液進(jìn)行灌根處理，每處理3株，3次重復(fù)；分別在處理后0、2、5、7 d取新開放的3～5朵花進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。

1.3 轉(zhuǎn)基因芥菜脅迫處理

將野生型和IN2-2：：GUS芥菜種子播于溫度為25 ℃/15 ℃（晝/夜，下同）的人工氣候室內(nèi)，30 d后幼苗生長至5片真葉左右，分別作如下處理：① 4 ℃恒溫培養(yǎng)箱處理；② 150 mmol·L-1的NaCl溶液灌根；③ 250 μmol·L-1的CuSO4溶液灌根。每處理3株，3次重復(fù)；脅迫處理0、3 d后取幼苗新生葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。

1.4 GUS組織化學(xué)染色

將樣品浸泡在染色液｛50 mmol·L-1的Na2HPO4和NaH2PO4混合液1 mL，0.1%的Triton X-100溶液0.1 mL，2 mmol·L-1的K3Fe（CN）6溶液0.2 mL，2 mmol·L-1的K4〔Fe（CN）6〕·3H2O溶液0.2 mL，10 mmol·L-1的EDTA溶液0.2 mL，2 mmol·L-1的X-Gluc溶液8.3 mL｝中，于37 ℃恒溫箱處理6 h；取出樣品先后用50%、70%、100%的乙醇漂洗，再加入100%乙醇浸泡直至完全脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜種子萌發(fā)期的表達(dá)

由圖1可知，不同濃度乙酰苯胺處理和清水處理IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽情況與野生型種子清水處理無明顯差異；而2-氯苯磺酰胺處理明顯抑制IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽，50 mg·L-1濃度處理的下胚軸長度遠(yuǎn)不及對(duì)照，100 mg·L-1和200 mg·L-1濃度處理的芥菜種子幾乎不能正常發(fā)芽，且發(fā)芽時(shí)間延長至7 d后胚軸仍未伸長（圖片未展示）。

圖1 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理對(duì)IN2-2：：GUS芥菜種子發(fā)芽的影響

處理3 d后的種子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖2所示，清水處理的IN2-2：：GUS種子發(fā)芽后無明顯GUS活性；乙酰苯胺處理的子葉、下胚軸及根中均有明顯的GUS活性，且根中GUS活性隨處理濃度的增加表現(xiàn)明顯的增強(qiáng)趨勢(shì)；50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理可誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在子葉、下胚軸以及根中表達(dá)，100、200 mg·L-1濃度處理未伸長的胚根中有微量的GUS活性。不同濃度乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺處理后，IN2-2：：GUS子葉和下胚軸中GUS活性均稍微弱于35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜，但100 mg·L-1和200 mg·L-1乙酰苯胺處理以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺處理的根中GUS活性明顯強(qiáng)于35S：：GUS轉(zhuǎn)基因芥菜。

圖2 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理3 d后的轉(zhuǎn)基因芥菜種子GUS組織化學(xué)染色

2.2 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜根中的表達(dá)

由圖3可知，野生型幼苗根部無GUS活性，而35S：：GUS幼苗根部可見明顯的GUS活性，IN2-2：：GUS幼苗部分根部誘導(dǎo)劑處理前有輕微表達(dá)；3個(gè)濃度的乙酰苯胺處理2 d后的根部均有明顯的GUS活性，5 d后活性增強(qiáng)，至第7天時(shí)活性下降；50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理2 d后根部有輕微的GUS活性，而100 mg·L-1和200 mg·L-1濃度處理2 d后與處理前無明顯差異，但3個(gè)濃度的2-氯苯磺酰胺處理5 d后均可見明顯的GUS活性，7 d后活性進(jìn)一步增強(qiáng)，且50 mg·L-1與100 mg·L-1濃度處理根部GUS表達(dá)活性明顯強(qiáng)于200 mg·L-1處理。上述結(jié)果表明，乙酰苯胺能更快啟動(dòng)IN2-2啟動(dòng)子在根中的表達(dá)，但處理5 d后表達(dá)水平下降；而2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在根中的表達(dá)較慢，處理7 d后達(dá)到表達(dá)高峰，但過高濃度處理明顯抑制IN2-2啟動(dòng)子在根中的表達(dá)。

2.3 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜葉片中的表達(dá)

圖3 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜幼苗根部GUS組織化學(xué)染色

圖4 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜幼苗葉片GUS組織化學(xué)染色

由圖4可知，35S：：GUS植株葉片中GUS活性強(qiáng)，而野生型植株葉片未檢測(cè)到任何GUS活性；部分IN2-2：：GUS植株處理前可在葉緣檢測(cè)到少量GUS活性；不同濃度乙酰苯胺處理2 d后的葉片可見較為明顯的GUS表達(dá)，5 d后表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，7 d后GUS表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低，其中100 mg·L-1乙酰苯胺誘導(dǎo)效果較好；2-氯苯磺酰胺處理2 d后葉片中GUS表達(dá)與處理前相比無明顯差異，50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理5 d后葉片中可見明顯的GUS表達(dá)，且50 mg·L-1濃度處理誘導(dǎo)表達(dá)效果強(qiáng)于100 mg·L-1處理，而200 mg·L-1濃度處理在葉片未見GUS活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理7 d后，GUS表達(dá)活性進(jìn)一步增強(qiáng)，但仍低于35S：：GUS。上述結(jié)果表明，盡管2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在葉片中表達(dá)反應(yīng)速度弱于乙酰苯胺，但在一定濃度下其誘導(dǎo)表達(dá)效果明顯優(yōu)于乙酰苯胺。

2.4 乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜花器官中的表達(dá)

由圖5可知，野生型植株花器官未見GUS表達(dá)，35S：：GUS植株花器官各部分均有GUS表達(dá)，雄蕊和花萼中表達(dá)尤其強(qiáng)烈。IN2-2：：GUS植株處理前均未見明顯的GUS表達(dá)。100 mg·L-1的乙酰苯胺處理2 d后，在花萼及雄蕊中見到明顯的GUS表達(dá)活性；5 d后不同濃度處理的花器官（花萼、花瓣、雄蕊）中均可見GUS表達(dá)，但仍以100 mg·L-1濃度處理的表達(dá)活性最強(qiáng)；第7天，3個(gè)濃度處理的花器官中基本檢測(cè)不到GUS活性。100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理2 d后，在花萼中可見微量的GUS表達(dá)，其余兩個(gè)濃度處理未見GUS表達(dá)；50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理5 d后，花器官各組織均可見GUS表達(dá)，但200 mg·L-1濃度處理僅在花萼中有微量表達(dá)活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1濃度處理7 d后，花器官中的GUS表達(dá)均有不同程度的下降，而200 mg·L-1濃度處理也基本檢測(cè)不到GUS表達(dá)活性。

圖5 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理后芥菜植株花器官GUS組織化學(xué)染色

由圖6可知，在野生型植株的花藥以及花粉中均無GUS活性，35S：：GUS植株花藥和花粉中均有明顯的GUS活性。經(jīng)不同濃度誘導(dǎo)劑處理5 d后，100 mg·L-1的乙酰苯胺和50 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理花藥和花粉中的GUS活性表達(dá)最強(qiáng)。35S：：GUS植株在柱頭和花柱中可檢測(cè)到較為明顯的GUS活性，但子房胚珠中未有任何GUS表達(dá)，而該現(xiàn)象在擬南芥中也被發(fā)現(xiàn)（Skinner et al.，2016）。100 mg·L-1和200 mg·L-1的乙酰苯胺處理5 d后，可在柱頭以及花柱表面檢測(cè)到少量GUS活性；50 mg·L-1和100 mg·L-1的2-氯苯磺酰胺處理5 d后，柱頭以及花柱表面的GUS活性強(qiáng)于乙酰苯胺處理，但兩種誘導(dǎo)劑各濃度處理均未發(fā)現(xiàn)子房中的胚珠表達(dá)GUS活性。

圖6 乙酰苯胺、2-氯苯磺酰胺處理5 d后芥菜花藥、花粉、花柱及胚珠GUS組織化學(xué)染色

上述結(jié)果表明，2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在花器官中的表達(dá)特性與在葉片中的表達(dá)相似，200 mg·L-1濃度抑制IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)。相對(duì)乙酰苯胺，2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)滯后，但誘導(dǎo)表達(dá)水平高于乙酰苯胺，持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間長于乙酰苯胺。另外，兩種化學(xué)誘導(dǎo)劑均能在適當(dāng)?shù)臐舛认抡T導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在花粉及花柱中表達(dá)，但不能誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在子房胚珠中表達(dá)。

2.5 環(huán)境脅迫誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜葉片中的表達(dá)

圖7 低溫、高鹽、重金屬離子誘導(dǎo)后芥菜葉片GUS組織化學(xué)染色

野生型幼苗在4 ℃低溫、150 mmol·L-1NaCl溶液以及250 μmol·L-1CuSO4溶液脅迫處理下均未檢測(cè)到任何GUS活性，IN2-2：：GUS幼苗僅個(gè)別葉片邊緣有極輕微的GUS活性呈現(xiàn)（圖7-A、B、C）。IN2-2：：GUS幼苗在4 ℃低溫脅迫3 d后，葉片可見明顯的GUS活性表達(dá)，顯示IN2-2啟動(dòng)子可被低溫逆境誘導(dǎo)表達(dá)（圖7-D）。150 mmol·L-1NaCl溶液處理3 d后，IN2-2：：GUS幼苗葉片有輕微GUS活性，顯示IN2-2啟動(dòng)子在高鹽脅迫下輕微誘導(dǎo)表達(dá)（圖7-E）。IN2-2：：GUS幼苗經(jīng)250 μmol·L-1CuSO4溶液脅迫3 d后，未在葉片中檢測(cè)到GUS活性（圖7-F），表明在芥菜中IN2-2啟動(dòng)子不受重金屬Cu2+的誘導(dǎo)表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

目前，基于激素、物理、化學(xué)誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子不斷被發(fā)現(xiàn)（Dutt et al．，2014）。除草劑安全劑誘導(dǎo)啟動(dòng)子屬于化學(xué)直接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中以來自于玉米的IN2-1、IN2-2（Hershey & Stoner，1991）、IN5-2（袁媛 等，2004）與GST27啟動(dòng)子（Jepson et al．，1994）研究及應(yīng)用較多。除草劑安全劑AD-67（苯叉酰胺）處理水稻幼苗后通過mRNA差異顯示法篩選到1個(gè)誘導(dǎo)后表達(dá)顯著增強(qiáng)的Yippee基因序列，但未見啟動(dòng)子表達(dá)特性的報(bào)道（殷得所 等，2007）。利用IN5-2啟動(dòng)子構(gòu)建了1套受2-氯-N-苯磺酰胺誘導(dǎo)調(diào)控的Cre/lox刪除系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了煙草選擇標(biāo)記基因的刪除（Yuan et al．，2004；Ma et al．，2011）。Choi等（2003）將IN2-2啟動(dòng)子與擴(kuò)展蛋白基因OsEXP4融合轉(zhuǎn)化水稻，通過2-CBSU誘導(dǎo)研究OsEXP4擴(kuò)展蛋白基因在水稻生長發(fā)育中的功能。除草劑安全劑誘導(dǎo)響應(yīng)元件一般位于ATG上游500 bp以內(nèi)，IN2-1啟動(dòng)子誘導(dǎo)元件（as-1a和as-1b）位于ATG上游-416～-315 bp之間，且-505～-416 bp之間可能有1個(gè)抑制誘導(dǎo)表達(dá)元件的存在（Behringer et al．，2011）。而IN5-2啟動(dòng)子中受2-chloro-N-（methylaminocarbonyl）benzenesulfonamide誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)元件可能位于ATG上游-388～-86 bp之間（袁媛 等，2004）；洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步顯示，該響應(yīng)元件位于-220～-143 bp之間（馬亮 等，2010）。結(jié)合IN2-2啟動(dòng)子在擬南芥以及水稻中的應(yīng)用（de Veylder et al．，1997；Choi et al．，2003），本試驗(yàn)中IN2-2啟動(dòng)子使用ATG上游463 bp長度的序列。

玉米IN2-1和IN2-2啟動(dòng)子受酰胺類除草劑安全劑誘導(dǎo)表達(dá)（Hershey & Stoner，1991）。分別用濃度為50 mg·L-1的4種不同的酰胺類除草劑安全劑處理IN2-2：：GUS擬南芥，僅2-CBSU誘導(dǎo)GUS基因在根、莖尖分生組織以及葉片排水孔中高效表達(dá)，其余3種安全劑只能誘導(dǎo)GUS基因在根中表達(dá)（de Veylder et al.，1997）。本試驗(yàn)中，乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺均能誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)，但表達(dá)模式存在一定的差異，乙酰苯胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在芥菜根與花器官中（包括花藥和花粉）表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量較少；而2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子在根、花器官（包括花藥和花粉）以及葉片中的表達(dá)量都比較高。乙酰苯胺誘導(dǎo)IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)水平較2-氯苯磺酰胺低，但誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)量達(dá)到峰值所需時(shí)間較2-氯苯磺酰胺短。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因被認(rèn)為與不同化學(xué)誘導(dǎo)物結(jié)構(gòu)差異影響其在植物不同組織細(xì)胞中的運(yùn)輸吸收有關(guān)（de Veylder et al.，1997）。相對(duì)傳統(tǒng)的四環(huán)素、糖皮質(zhì)激素、乙醇和銅離子等化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，盡管除草劑安全劑化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)更為簡(jiǎn)單，但該系統(tǒng)中哪些基因參與到IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控是不清楚的（de Veylder et al．，1997）。因此，本試驗(yàn)中乙酰苯胺處理濃度范圍內(nèi)，盡管200 mg·L-1處理對(duì)植株生長發(fā)育無明顯的影響，但其在根、葉片以及花器官中的表達(dá)水平卻低于100 mg·L-1處理，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因有待于進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)2-氯苯磺酰胺處理抑制芥菜種子發(fā)芽，100 mg·L-1與200 mg·L-1濃度處理對(duì)轉(zhuǎn)基因芥菜植株產(chǎn)生藥害，出現(xiàn)較嚴(yán)重的葉片卷曲，且該現(xiàn)象在IN2-2：：GUS轉(zhuǎn)基因番茄上也有表現(xiàn)（結(jié)果未展示）。在擬南芥中，4種除草劑安全劑超過一定濃度也不同程度的影響種子發(fā)芽、根伸長以及葉片形態(tài)（de Veylder et al．，1997）。因此，從本試驗(yàn)結(jié)果來看，IN2-2啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)特性在單子葉和雙子葉植物中具有保守性（de Veylder et al．，1997），其作為化學(xué)誘導(dǎo)劑直接誘導(dǎo)啟動(dòng)子應(yīng)用于雙子葉植物的分子生物學(xué)研究是可行的。另外，乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺均可作為2-CBSU的替代誘導(dǎo)物用于調(diào)控IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)，100 mg·L-1乙酰苯胺以及50 mg·L-12-氯苯磺酰胺適合用于在芥菜中調(diào)控IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)，該濃度條件下藥劑對(duì)植株的生長發(fā)育無毒害作用且可實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子表達(dá)的良好調(diào)控。

化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)在大田環(huán)境中的嚴(yán)謹(jǐn)性是能否應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一（Padidam，2003）。在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，IN2-2啟動(dòng)子可在日歷苗齡21～28 d的擬南芥植株根表皮細(xì)胞中檢測(cè)到微量的GUS活性，但在21 d以前的植株中未檢測(cè)到GUS表達(dá)（de Veylder et al.，1997）。GST-27啟動(dòng)子即使在缺少誘導(dǎo)劑的情況下，在馬鈴薯莖、根和膨大塊莖中均可檢測(cè)到明顯的表達(dá)（Robertson et al.，2000）。本試驗(yàn)中，剛發(fā)芽的芥菜根中未檢測(cè)到IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)；未添加誘導(dǎo)劑的情況下，在日歷苗齡約30 d的芥菜幼苗葉片中無表達(dá)，45 d后的幼苗可在部分根以及葉片中檢測(cè)到微量的GUS活性；開花后的花器官未添加誘導(dǎo)物時(shí)IN2-2啟動(dòng)子不表達(dá)。因此，IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)泄露可能與組織器官以及發(fā)育階段有關(guān)。玉米植株經(jīng)機(jī)械損傷、熱擊、高鹽脅迫、GA處理均不能誘導(dǎo)IN2-1、IN2-2啟動(dòng)子的表達(dá)（Hershey & Stoner，1991）。但本試驗(yàn)中，IN2-2啟動(dòng)子在芥菜葉片中的表達(dá)不受Cu2+的誘導(dǎo)，但輕微受到高鹽的誘導(dǎo)表達(dá)，在4 ℃低溫脅迫下可見明顯的表達(dá)。如何實(shí)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋磉_(dá)是一個(gè)較為復(fù)雜的問題。如PR-1a啟動(dòng)子主要受二叔丁對(duì)甲酚（BTH）的誘導(dǎo)（G?rlach et al．，1996），但該啟動(dòng)子也受環(huán)境條件如紫外照射、SO2、臭氧等脅迫因素的誘導(dǎo)表達(dá)（Green & Fluhr，1995；Sharma et al．，1996）。因此，可通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控元件的精確分析和突變改造（Kiran et al．，2006；Srivastava et al．，2014），提高表達(dá)水平及嚴(yán)謹(jǐn)性。目前，包括IN2-2、IN2-5等除草劑安全劑誘導(dǎo)啟動(dòng)子與其他系統(tǒng)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了基因刪除、雄性不育調(diào)控、轉(zhuǎn)基因植株篩選等（Cigan et al．，2001；Yuan et al．，2004；Ma et al．，2011；Cho et al．，2014）。因此，結(jié)合其他分子系統(tǒng)改造IN2-2啟動(dòng)子表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)性，將有助于實(shí)現(xiàn)植物目標(biāo)基因的精確及復(fù)雜調(diào)控。

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Expression of IN2-2 Promoter Induced by Acetanilide and 2-Chlorobenzenesulfonamide in Mustard

ZHOU Wen，SUN Fang-fang，DU Yang-mei，MA Cun-fa，ZHU Chen-zeng，ZHEN Min，REN Xuesong，SI Jun，SONG Hong-yuan*

（CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，SouthwestUniversity，KeyLaboratoryofHorticultureSciencefor SouthernMountainsRegions，MinistryofEducation，ChongqingKeyLaboratoryofOlericulture，Chongqing400715，China）

IN2-2：：GUStransgenic mustard was treated with different concentrations（50、100、200 mg·L-1）of acetanilide and 2-chlorobenzenesulfonamide，the herbicide safer analogous chemicals．The results showed thatIN2-2promoter expressed in mustard roots，leaves，flower calyx，petal，stamen and pollen after treated with acetanilide or 2-chlorobenzenesulfonamide，but no GUS expression activity was observed in ovule．100 mg·L-1acetanilide or 50 mg·L-12-chlorobenzenesulfonamide solution were suitable for the expression ofIN2-2promoter in mustard，and the acetanilide induce theIN2-2promoter expression more quickly than 2-chlorobenzenesulfonamide in all tissues and organs．In addition，high concentration 2-chlorobenzenesulfonamide treatment was detrimental to mustard germination and growth，and would obviously inhibit the expression activity ofIN2-2promoter．4 ℃ temperature stress inducedIN2-2promoter expression in seedling leaf blades．This promoter expression was slightly induced by 150 mmol·L-1NaCl，but not by heavy metalions Gu2+．

IN2-2promoter；Acetanilide；2-Chlorobenzenesulfonamide；Mustard；GUS expression

周雯，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜育種與生物技術(shù)，E-mail：869217196@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：宋洪元，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種及生物技術(shù)，E-mail：yuahs@163.com

2016-11-07；接受日期：2017-03-03

重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2015shmsztzx80005，cstc2015shms-ztzx80007，cstc2015shms-ztzx80009）