嚴(yán) 碩 張戰(zhàn)泓 劉 勇 史曉斌* 張德詠*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南長沙410128；3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南長沙 410128）

內(nèi)共生菌Buchnera對(duì)桃蚜生長發(fā)育的影響

嚴(yán) 碩1，2張戰(zhàn)泓3劉 勇2史曉斌2*張德詠1，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南長沙410128；3湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖南長沙 410128）

為明確桃蚜內(nèi)共生菌Buchnera aphidicola對(duì)桃蚜生長發(fā)育和繁殖的影響，為有效控制桃蚜提供新的思路，本試驗(yàn)以十字花科（蘿卜）、茄科（辣椒）和葫蘆科（黃瓜）蔬菜為試材，比較健康桃蚜和利福平處理后的桃蚜在3種蔬菜上的生長發(fā)育和繁殖情況。結(jié)果表明，不同濃度利福平處理后桃蚜Buchnera的DNAK基因表達(dá)量均顯著降低；200 μg·mL-1利福平處理后的桃蚜產(chǎn)蚜量、壽命和體重都顯著低于健康桃蚜。說明桃蚜的內(nèi)共生菌Buchnera在其生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用，降低內(nèi)共生菌的量對(duì)桃蚜可產(chǎn)生不利影響。

桃蚜；內(nèi)共生菌；利福平；蔬菜；生長發(fā)育

蚜蟲是蔬菜生產(chǎn)中的重要害蟲，種類多、繁殖快。蚜蟲通常密集為害，刺吸植物汁液，造成植物嚴(yán)重失去水分和營養(yǎng)，葉面皺縮、發(fā)黃。蚜蟲取食時(shí)還可分泌蜜露，引發(fā)煤污病。此外，蚜蟲還可以傳播多種病毒病，造成更大的損失。

大多數(shù)蚜蟲體內(nèi)都含有初生內(nèi)共生菌——Buchnera aphidicola（Baumann et al.，1995）。蚜蟲與Buchnera之間存在著互利共生的關(guān)系，這種關(guān)系是長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果（Hansen & Moran，2014）。蚜蟲為內(nèi)共生菌提供生存環(huán)境和營養(yǎng)來源，內(nèi)共生菌為蚜蟲的生長發(fā)育提供多種必需的營養(yǎng)物質(zhì)，幫助蚜蟲抵御天敵（Hunter et al.，2003；Oliver et al.，2003），在蚜蟲的新陳代謝中發(fā)揮著重要的作用（Douglas，1998；McLean et al.，2011）。抑制蚜蟲體內(nèi)的共生菌不但可以直接或間接地控制蚜蟲，而且還可有效提高殺蟲劑的防治效果，最終實(shí)現(xiàn)“抑菌防蟲”，對(duì)蚜蟲防治具有非常重要的意義。

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對(duì)多種病原微生物均具有抗菌活性，本試驗(yàn)采用利福平處理桃蚜來達(dá)到抑制桃蚜內(nèi)共生菌的效果，并比較了健康桃蚜和抗生素處理的桃蚜在3種蔬菜上的生長發(fā)育情況，以明確內(nèi)共生菌對(duì)不同蔬菜上的桃蚜生長發(fā)育的影響，從而為蚜蟲的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年6月開始進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。以十字花科蔬菜蘿卜、茄科蔬菜辣椒、葫蘆科蔬菜黃瓜為試材，蘿卜（Raphanus sativusLinn.）品種為中蔬紅櫻桃、辣椒（Capsicum annuumL.）品種為中椒5號(hào)、黃瓜（Cucumis sativusL.）品種為中農(nóng)8號(hào)，均購自中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司。

供試蟲源為湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所在室內(nèi)煙草上飼養(yǎng)的桃蚜種群，試驗(yàn)前分別在3種蔬菜上飼養(yǎng)了60 d，進(jìn)行適應(yīng)性鍛煉，并建立了3種蔬菜上的桃蚜種群。

1.2 利福平處理對(duì)桃蚜內(nèi)共生菌的影響

用30%（m∶V） 蔗 糖 溶 液 將 利 福 平（Rifampicin，優(yōu)級(jí)純GR，Sigma公司）配置成10、50、100、200 μg·mL-14個(gè)濃度水平；對(duì)照為相同濃度的蔗糖溶液。在玻璃管上端以雙層Parafilm膜覆蓋，中間分別加入200 μL含利福平和不含利福平的蔗糖溶液。每個(gè)玻璃管放入50頭經(jīng)過饑餓處理6 h、發(fā)育一致的成蚜，玻璃管下端用單層Parafilm膜覆蓋。將玻璃管四周用錫箔紙包好，放入光照培養(yǎng)箱中，控制條件為溫度（25±1）℃，光周期14 L∶10 D，RH = 60%。處理48 h后將存活的蚜蟲取出，用qPCR測(cè)定內(nèi)共生菌表達(dá)量，每個(gè)處理進(jìn)行8次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含4次技術(shù)重復(fù)。qPCR引物根據(jù)內(nèi)共生菌的DNAK基因設(shè)計(jì)（F：5′-ATGGGTAAAATTATTGGTATTG-3′，R：5′-ATAGCTTGACGTTTAGCAGG-3′）（Wilson et al.，2006），根據(jù)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果，選取200 μg·mL-1處理桃蚜并在3種蔬菜上觀察其生長發(fā)育情況。

1.3 桃蚜生長發(fā)育觀察

利福平處理對(duì)桃蚜產(chǎn)蚜量和壽命的影響：取同期播種的苗齡30 d的蘿卜、辣椒和黃瓜幼苗，分別單株置于潔凈的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，將剛完成蛻皮的健康成蚜和經(jīng)200 μg·mL-1利福平處理后的成蚜接種到植物上，每株幼苗上放1頭成蚜，在主莖稈上涂1圈凡士林防止蚜蟲逃逸。每天觀察蚜蟲的存活情況和產(chǎn)蚜量，用毛筆輕輕除去若蚜，直至所有蚜蟲死亡。每種蔬菜作物10次重復(fù)。

利福平處理對(duì)桃蚜發(fā)育歷期的影響：將健康初生若蚜和200 μg·mL-1利福平處理后的若蚜每10頭1組，分別放在上述不同無蟲籠內(nèi)的3種蔬菜作物上，每隔8 h調(diào)查若蚜數(shù)量和蛻皮數(shù)，直至成蚜，記錄發(fā)育歷期，并計(jì)算平均值。每種蔬菜作物10次重復(fù)。

利福平處理對(duì)桃蚜體重的影響：每株幼苗上分別放置50頭健康的和200 μg·mL-1利福平處理后的發(fā)育時(shí)間相同的成蚜，飼養(yǎng)5 d后，在每株幼苗上隨機(jī)選取健康的和200 μg·mL-1利福平處理后的成蚜20頭稱體重。每種蔬菜作物10次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件記錄和處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利福平處理對(duì)桃蚜內(nèi)共生菌的表達(dá)量分析采用單因素方差分析，用Tukey檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異比較；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較健康桃蚜和抗生素處理的桃蚜的生長發(fā)育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 利福平處理對(duì)桃蚜內(nèi)共生菌的影響

由圖1可以看出，隨著抗生素利福平濃度的增大，桃蚜內(nèi)共生菌Buchnera的DNAK基因表達(dá)量逐漸降低，與對(duì)照差異極顯著。其中200 μg·mL-1利福平處理后，內(nèi)共生菌Buchnera的DNAK基因表達(dá)量最低。

圖1 利福平處理對(duì)桃蚜內(nèi)共生菌的影響

2.2 利福平處理對(duì)桃蚜生長發(fā)育的影響

由圖2可以看出，蘿卜、辣椒和黃瓜上健康桃蚜的平均產(chǎn)蚜量依次為48、35、23頭·株-1；用200 μg·mL-1利福平處理后，產(chǎn)蚜量均顯著降低，蘿卜、辣椒和黃瓜上桃蚜的平均產(chǎn)蚜量依次為39、26、16頭·株-1。

圖2 利福平處理對(duì)桃蚜產(chǎn)蚜量的影響

由圖3可以看出，蘿卜、辣椒和黃瓜上健康桃蚜的平均壽命依次為15、13、10 d；200 μg·mL-1利福平處理顯著降低了桃蚜的平均壽命，蘿卜、辣椒和黃瓜上桃蚜的平均壽命分別為10、8、5 d。

圖3 利福平處理對(duì)桃蚜壽命的影響

由圖4可以看出，桃蚜在黃瓜、辣椒和蘿卜上的平均發(fā)育歷期依次為8、7、6 d。用200 μg·mL-1利福平處理后，3種蔬菜上桃蚜的平均發(fā)育歷期與健康桃蚜相比無顯著差異。

由圖5可以看出，蘿卜、辣椒和黃瓜上桃蚜的平均體重依次為0.14、0.12、0.11 g；200 μg·mL-1利福平處理顯著降低了桃蚜的體重，蘿卜、辣椒和黃瓜上桃蚜的平均體重依次為0.10、0.07、0.06 g。

圖4 利福平處理對(duì)桃蚜發(fā)育歷期的影響

圖5 利福平處理對(duì)桃蚜體重的影響

3 結(jié)論與討論

內(nèi)共生菌與昆蟲在長期的進(jìn)化過程中形成了非常密切的共生關(guān)系，在昆蟲的生長、發(fā)育以及進(jìn)化等方面都有著非常重要的意義。研究二者之間的互作關(guān)系不僅可以揭示不同物種的進(jìn)化方式及機(jī)制，而且可以為今后的害蟲防治提供參考（李正西和李定旭，2005；譚周進(jìn) 等，2005；馮利 等，2008）。

研究表明，利福平處理可以去除蚜蟲體內(nèi)的共生菌（Prosser & Douglas，1991；Miao & Ding，2003）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的利福平處理后，桃蚜內(nèi)共生菌Buchnera的DNAK基因表達(dá)量極顯著低于健康桃蚜，然而在濃度達(dá)到200 μg·mL-1時(shí)仍未將Buchnera全部去除?？赡苁怯捎贐uchnera屬于初生內(nèi)共生菌，與蚜蟲一起共同進(jìn)化，且能夠?yàn)檠料x提供營養(yǎng)物質(zhì)，因而蚜蟲對(duì)其有一定的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利福平處理后的桃蚜在3種蔬菜上的生物學(xué)特性均顯著降低，具體表現(xiàn)為產(chǎn)蚜量下降、壽命縮短、體重降低，說明桃蚜的內(nèi)共生菌Buchnera在其生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。目前蚜蟲的防治主要靠化學(xué)防治，大量使用農(nóng)藥引起了蚜蟲抗藥性的產(chǎn)生以及環(huán)境污染等一系列問題（高亮，2002；劉奎 等，2010）。未來可以嘗試通過“抑菌防蟲”的手段來控制蚜蟲，即通過外源物質(zhì)抑制蚜蟲的內(nèi)共生菌來達(dá)到防治目的。隨著現(xiàn)代微生物和生物技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，“抑菌防蟲”將在蚜蟲及其他害蟲防治中發(fā)揮重要的作用。

馮利，孫玉誠，戈峰，馬駿．2008．蚜蟲—內(nèi)共生菌的互利共生研究綜述．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，20（6）：65-68．

高亮．2002．百部·楝·煙乳油防治桃蚜及其在萵苣上的殘留試驗(yàn)．中國蔬菜，（4）：12-14．

李正西，李定旭．2005．桃蚜自然種群初級(jí)和次級(jí)胞內(nèi)共生菌的分子鑒定．昆蟲學(xué)報(bào)，48（5）：810-814．

劉奎，許江，林上統(tǒng)，關(guān)義甫，盧輝，鐘義海．2010．防治豇豆蚜蟲和美洲斑潛蠅的田間藥效試驗(yàn)．中國蔬菜，（6）：63-66．

譚周進(jìn)，肖啟明，謝丙炎．2005．昆蟲內(nèi)胞內(nèi)共生菌研究概況．微生物學(xué)通報(bào)，32（4）：140-143．

Baumann P，Baumann L，Lai C Y，Rouhbakhsh D，Moran N A，Clark M A．1995．Genetics，physiology，and evolutionary relaionships of the genus Buchnera：intracellular symbionts of aphids．Annu Rev Microbiol，49：55-94．

Douglas A E．1998．Nutritional interactions in insect-microbial symbioses：aphids and their symbiotic bacteria Buchnera．Annu Rev Entomol，43：17-37．

Hansen A K，Moran N A．2014．The impact of microbial symbionts on host plant utilization by herbivorous insects．Mol Ecol，23（6）：1473-1496．

Hunter M S，Perlman S J，Kelly S E．2003．A bacterial symbiont in the Bacteroidetes induces cytoplasmic incompatibility in the parasitoid wasp Encarsia pergandiella．Proc R Soc B，270：2185-2190．

McLean A H C，van Asch M，F(xiàn)errari J，Godfray H C J．2011．Effects of bacterial secondary symbionts on host plant use in pea aphids．Proc R Soc B，278：760-766．

Miao X X，Ding D C．2003．Interaction between aphids and its intracellular bacterial symbionts Buchnera．Entomol Sin，10（3）：167-171．

Oliver K M，Russell J A，Moran N A，Hunter M S．2003．Facultative bacterial symbionts in aphids confer resistance to parasitic wasps．PNAS，100（4）：1803-1807．

Prosser W A，Douglas A E．1991．The aposymbiotic aphid：an analysis of chlortetracyeline-treated pea aphid，Acyrthosiphon pisum．Insect Physiol，37：713-719．

Wilson A C，Dunbar H E，Davis G K，Hunter W B，Stern D L，Moran N A．2006．A dual-genome microarray for the pea aphid，Acyrthosiphon pisum，and its obligate bacterial symbiont，Buchnera aphidicola．BMC Genomics，7（1）：50．

Effects of Buchnera on Myzus persicae Growth and Development

YAN Shuo1，2，ZHANG Zhan-hong3，LIU Yong2，SHI Xiao-bin2*，ZHANG De-yong1，2*

（1PlantProtectionCollegeofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，Hunan，China；2PlantProtection Institute，HunanProvincialAcademyofAgriculturalSciences，Changsha410128，Hunan，China；3VegetableInstitute，HunanProvincialAcademyofAgriculturalSciences，Changsha410128，Hunan，China）

In order to clarify the effects ofBuchnera aphidicolaon growth and development ofM. persicaein different vegetables，we took vegetables of 3 different families（ radish ofRaphanus sativusL.，pepper ofCapsicum annuumL.，and cucumber ofCucumis sativusL.） as experimental material，and compared the growth and reproduction situation ofM. persicaeuntreated and treated with Rifampicin．The results showed that theDNAKgene expression quantity ofBuchnerain aphids treated with different concentrations of rifampicin was significantly decreased．After treated with 200 μg·mL-1rifampicin，the reproduction quantity，life span and body weight of aphids were significantly lower than that of the healthy aphids，indicating that endosymbiontBuchneraplayed a very important role in the growth and development ofM. persicae，and the reduction of endosymbiont could have negative effect onM. persicae．

Myzus persicae；Endosymbiosis；Rifampicin；Vegetable；Growth and development

嚴(yán)碩，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜害蟲與內(nèi)共生菌互作，E-mail：334049858@qq.com

*通訊作者（Corresponding authors）：張德詠，男，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：dyzhang78@163.com；史曉斌，女，助理研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：媒介昆蟲與植物病毒互作，E-mail：xiaobin.s@163.com

2016-12-19；接受日期：2017-03-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571981，31672003，31501643）