李穎芳 桑軍軍 李娟 姜偉偉 廖萬清 潘煒華

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點實驗室 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

·論著·

轉(zhuǎn)化生長因子對巨噬細胞抗新生隱球菌功能的影響

李穎芳 桑軍軍 李娟 姜偉偉 廖萬清 潘煒華

(上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點實驗室 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子對巨噬細胞吞噬和殺傷新生隱球菌 (Cryptococcusneoformans)功能的影響。方法 采用TGF-β干預(yù)體外活化巨噬細胞吞噬和殺傷實驗，分別觀察巨噬細胞吞噬率和巨噬細胞內(nèi)隱球菌生長情況，采用Griess regent試劑盒檢測巨噬細胞NO (Nitric oxide)生成量,并比較TGF-β干預(yù)下巨噬細胞NO生成量變化。結(jié)果 TGF-β干預(yù)后巨噬細胞吞噬率下降了43.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。巨噬細胞在轉(zhuǎn)化生長因子干預(yù)下NO生成量增加，胞內(nèi)隱球菌負荷降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論 體外細胞實驗中，在TGF-β干預(yù)下活化巨噬細胞的趨化作用和吞噬能力受抑制，但巨噬細胞合成NO量增加，殺傷隱球菌能力增強。

新生隱球菌；轉(zhuǎn)化生長因子；巨噬細胞

隱球菌是臨床上最重要的深部真菌病感染源之一，其中新生隱球菌 (Cryptococcusneoformans)主要感染免疫功能抑制的患者，可引發(fā)具有致命性的隱球菌性腦膜炎[1]。

吞噬細胞是新生隱球菌侵入宿主體內(nèi)所遭遇的第一類免疫細胞，人體的吞噬細胞主要有巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等，其中單核/巨噬細胞是宿主抗隱球菌感染最主要的效應(yīng)細胞之一[2-3]。巨噬細胞一方面通過內(nèi)吞與氧化殺傷的方式在第一時間非特異性地抵抗入侵的隱球菌，另一方面以釋放趨化因子的方式募集T細胞至感染部位，形成局部細胞因子微環(huán)境，并通過抗原遞呈調(diào)控后續(xù)獲得性免疫[4]。

轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF-β)主要由淋巴細胞或巨噬細胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)細胞免疫過程中起重要作用，它被認為是免疫抑制的一個重要因素[5-6]。TGF-β可抑制巨噬細胞吞噬反應(yīng)，減少趨化因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)[7]。本研究旨在探索TGF-β對巨噬細胞在吞噬、殺傷隱球菌方面的影響，從而深入了解TGF-β在機體抗隱球菌感染方面的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 選用新生隱球菌標準株H99 (第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所真菌庫)。

細胞 小鼠單核巨噬細胞J774A.1 (上海生科院巴斯德研究所孟廣勛研究員惠贈)。

培養(yǎng)基 YPD固體培養(yǎng)基：10% Yeast Extract (酵母膏)+20% Peptone (蛋白胨)+20% Glucose (葡萄糖)+20% Agar (瓊脂粉)，YPD液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)基：DMEM+10% FBS (胎牛血清)+1%雙抗 (Penicillin-Streptomycin)購自美國Gibco公司。

主要試劑 重組小鼠轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1 (美國R&D公司)，小鼠TGF-β1單克隆抗體 (美國R&D公司)，氨基胍鹽酸鹽 (德國Sigma-Aldrich公司)，瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液 (北京Leagene生物技術(shù)有限公司)，一氧化氮檢測試劑盒Griess regent (碧云天生物技術(shù)公司)。

主要儀器和耗材 CO2恒溫培養(yǎng)箱 (德國Hetaeus公司)，普通光學(xué)顯微鏡 (德國Zeiss蔡司)，倒置顯微鏡 (德國Zeiss蔡司)，分光光度計 (美國BIO-RAD公司)，Spectrostar nano高通量紫外分光光度計 (德國BMG LABTECH公司)，6孔細胞培養(yǎng)板和96孔細胞培養(yǎng)板 (美國Corning公司)。

1.2 實驗方法

菌株的復(fù)蘇和菌懸液的配置 從-80℃冰箱取出新生隱球菌標準株H99，用接種環(huán)挑取菌液，接種于YPD固體培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。從平板上挑取單克隆菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基，30℃，220 r/min過夜。

巨噬細胞的復(fù)蘇及培養(yǎng) 巨噬細胞從液氮罐中取出，迅速于37℃恒溫水浴箱中溶化，取解凍的細胞懸浮液置于DMEM培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱 (5% CO2)，37℃環(huán)境培養(yǎng)。

巨噬細胞吞噬實驗 將J774A.1巨噬細胞濃度調(diào)至2×106/mL，接種至6孔板中細胞爬片上，并加入IFN-γ和LPS激活巨噬細胞。分三組干預(yù)，A組為陰性對照，B組按100 ng/mL加入TGF-β干預(yù)，C組加入TGF-β單克隆抗體和TGF-β干預(yù)，孵育2 h。將H99菌懸液濃度調(diào)整至2×106cells/mL并加入隱球菌莢膜抗體mAb 18b7共孵育后感染巨噬細胞，孵育2 h。取出細胞爬片緩緩沖洗，用無水甲醇固定10 min，棄去甲醇，加入1∶10稀釋 (PBS)的Giemsa染液于4℃染色2 h，沖洗烘干后置于顯微鏡下觀察，每塊細胞爬片取4個視野觀察，取平均值。吞噬指數(shù)=視野中所有被吞噬的隱球菌數(shù)目/視野中所有巨噬細胞數(shù)目。

巨噬細胞殺傷實驗 將2×106/mL巨噬細胞接種于96孔板內(nèi)，加入激活培養(yǎng)基，將濃度為2×106cells/mL的隱球菌感染巨噬細胞，孵育2 h后PBS洗滌3遍。之后分3組干預(yù)，A組加入DMEM培養(yǎng)基，B組TGF-β 100 ng/mL+DMEM培養(yǎng)基，C組加入含抗TGF-β 100 ng/mL+DMEM培養(yǎng)基150 μL (提前已加入TGF-β單克隆抗體)，孵育24 h。加入0.5% SDS,室溫下孵育5 min，吸打若干次使巨噬細胞充分裂解，將裂解產(chǎn)物稀釋后涂板計數(shù)。

一氧化氮檢測 于96孔內(nèi)接種2×106/mL巨噬細胞，加入IFN-γ和LPS，分4組干預(yù)，A組不加TGF-β干預(yù)，B組按加入TGF-β，C組加入1 mmol/L iNOS抑制劑氨基胍+TGF-β，孵育1 h。將H99隱球菌懸液加入A、B、C組中，繼續(xù)孵育20 h，D組為對照組，不予隱球菌感染巨噬細胞。使用Griess regent檢測NO含量，反應(yīng)結(jié)束后在540 nm處測定樣品吸光度，收集數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行處理，巨噬細胞吞噬率、巨噬細胞內(nèi)隱球菌負荷和NO含量比較均采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β對巨噬細胞吞噬功能的影響

吉姆薩染色后高倍鏡下觀察，J774A.1巨噬細胞胞漿呈淡染，巨噬細胞細胞核及隱球菌菌體呈深染，隱球菌莢膜不被染色，表現(xiàn)為菌體周圍的白色光暈 (見圖1)，觀察巨噬細胞趨化和吞噬情況，計算每組巨噬細胞吞噬率。

統(tǒng)計各組巨噬細胞吞噬率，結(jié)果顯示TGF-β干預(yù)時，巨噬細胞趨化作用減弱，吞噬指數(shù)較對照組下降了43.9%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。而加入TGF-β單克隆抗體可阻斷TGF-β對巨噬細胞吞噬功能的影響，巨噬細胞趨化作用恢復(fù)，巨噬細胞吞噬率與陰性對照組接近 (見圖2)。

2.2 TGF-β對J774.1巨噬細胞殺傷隱球菌能力的影響

將巨噬細胞裂解產(chǎn)物涂板培養(yǎng)，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，TGF-β干預(yù)巨噬細胞后，被巨噬細胞吞入胞內(nèi)的隱球菌存活率下降明顯，菌落負荷下降，表明巨噬細胞在TGF-β干預(yù)后胞內(nèi)殺傷能力升高 (P<0.05)。為進一步證明TGF-β在對巨噬細胞殺傷能力方面的影響，提前加入TGF-β單克隆抗體干預(yù)，可見TGF-β活性被單克隆抗體阻斷，巨噬細胞殺傷胞內(nèi)隱球菌的功能未增強 (見圖3)。

2.3 TGF-β對J774.1巨噬細胞NO合成量的影響

本實驗中未予隱球菌感染的對照組，巨噬細胞NO合成量極低，在予以新生隱球菌感染后，NO含量上升，其中TGF-β干預(yù)組NO含量升高較未加TGF-β組升高顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)，但在加入一氧化氮合酶抑制劑氨基胍后，NO合成顯著受抑制 (見圖4)。

圖1 左圖黑色箭頭所指為巨噬細胞趨化聚集，巨噬細胞黏附及吞噬新生隱球菌，右圖紅色箭頭所指J774A.1巨噬細胞，綠色箭頭指為被黏附及吞噬的新生隱球菌 (放大倍數(shù)400×) 圖2 TGF-β對J774A.1巨噬細胞吞噬指數(shù)影響 圖3 TGF-β干預(yù)下對巨噬細胞內(nèi)隱球菌負荷的影響 圖4 TGF-β對J774.1巨噬細胞NO合成量的影響

Fig.1 The black arrow indicates macrophage chemotaxis,adhesion and phagocytosis ofC.neoformans(Left).The red arrow indicates J774A.1 macrophages and the green arrow points the adhered and swallowedC.neoformans(Right) (400×magnification) Fig.2 Effects of TGF-β treatment on J774A.1 macrophages phagocytic index Fig.3 Effects of TGF-β intervention on the intracellular CFU ofC.neoformansFig.4 Effects of TGF-β intervention on nitric oxide synthesis in J774A.1 macrophages

3 討 論

肺巨噬細胞是隱球菌進入機體內(nèi)接觸的第一類免疫細胞，其在宿主抗隱球菌免疫反應(yīng)中扮演雙重角色[8]。巨噬細胞接觸隱球菌后，一方面可吞噬殺傷隱球菌并可將抗原提呈給T淋巴細胞觸發(fā)特異性免疫，使感染局限化進而清除隱球菌，而另一方面隱球菌可在巨噬細胞內(nèi)生長增殖進而發(fā)展為肺隱球菌病，甚至可將巨噬細胞作為載體，通過“特洛伊木馬”模型通過血腦屏障，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成腦部感染?；罨木奘杉毎δ苋Q于細胞因子微環(huán)境，吞噬入巨噬細胞胞內(nèi)隱球菌的命運與局部細胞因子微環(huán)境相關(guān)[9]。

轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面有重要作用[10]，而TGF-β在新生隱球菌感染宿主免疫方面的作用仍不明確。本研究從TGF-β對巨噬細胞功能的影響著手，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，加入TGF-β干預(yù)活化巨噬細胞時其趨化作用減弱，吞噬新生隱球菌能力呈現(xiàn)下降趨勢，而在加入TGF-β單克隆抗體抑制其生物學(xué)功能后，巨噬細胞吞噬能力恢復(fù)，吞噬率與陰性對照組相近，說明TGF-β可抑制體外巨噬細胞吞噬功能，減少對新生隱球菌的吞噬。

巨噬細胞可通過氧化損傷方式殺傷隱球菌，隱球菌被吞入巨噬細胞后的結(jié)局取決于巨噬細胞的殺傷能力，進一步研究TGF-β對巨噬細胞殺傷功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β干預(yù)后，巨噬細胞胞內(nèi)隱球菌生長受抑制，將巨噬細胞裂解后細胞液涂板計數(shù)，菌落負荷明顯下降，且該效應(yīng)可經(jīng)TGF-β單克隆抗體阻斷，表明TGF-β在增強巨噬細胞殺傷能力方面起一定作用。巨噬細胞可生成iNOS從而合成活性氮自由基NO而發(fā)揮抗菌作用，主要殺傷被吞噬的隱球菌[11]，本研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β干預(yù)下巨噬細胞NO生成量增加，加入iNOS抑制劑氨基胍后NO含量極低，說明TGF-β可通過增強iNOS活性從而促進NO的產(chǎn)生，進而增強巨噬細胞對隱球菌的殺傷能力。

綜上，TGF-β可抑制巨噬細胞的趨化和吞噬作用，但可通過增強iNOS活性而提高巨噬細胞的殺傷能力，TGF-β干預(yù)下巨噬細胞胞內(nèi)隱球菌生長受限。本實驗僅在體外細胞實驗層面研究TGF-β在巨噬細胞抗隱球菌當中的作用，轉(zhuǎn)化生長因子在機體抗隱球菌方面的整體作用有待今后進一步研究，以尋找對隱球菌病干預(yù)治療的新靶點。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Effects of transforming growth factor on the function of macrophage againstCryptococcusneoformans

LI Ying-Fang,SANG Jun-Jun,LI Juan,JIANG Wei-Wei,LIAO Wan-Qing,PAN Wei-Hua

(Departmentofdermatology，ChangzhengHospital，Instituteofdermatologyandmedicalmycology，ChangzhengHospital，Keylaboratoryofmolecularmedicalmycology，PLAkeylaboratoryofmedicalmycology，Shanghai200003)

Objective To investigate the phagocytosis and killing ability of macrophage under TGF-β intervention.Methods Using TGF-β intervene phagocytosis and killing assay of activated macrophagesinvitro.Phagocytic index of macrophage and the intracellular growth ofCryptococcusneoformanswas observed respectively.Nitric oxide (NO) production was detected using the Griess regent kit，and then comparing the changes of NO production in macrophages under the TGF-β intervention.Results The phagocytic index with the treatment of TGF-β decreased by 43.9%,significantly lower than control group (P<0.05).While the production of NO increased and the intracellular fungal burden significantly declined under the intervention of TGF-β (P<0.05).Conclusion Chemotaxis and phagocytosis of activated macrophage were inhibited under the intervention of TGF-βinvitro,but the NO production increased and killing ability enhanced.

Cryptococcusneoformans；transforming growth factor；macrophage

65-68]

973項目 (2013CB531606),國家自然基金 (31270180)

李穎芳，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:liyingfang99@163.com

潘煒華,E-mail:panweihua@medmail.com.cn

R 379.5

A

1673-3827(2017)12-0065-04

2017-03-03