李穎 徐英春

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

·論著·

評價ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌種鑒定方面的應(yīng)用

李穎 徐英春

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

目的 評價內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)、β-微管蛋白基因 (BenA)和鈣調(diào)蛋白基因 (CaM)序列分析技術(shù)對曲霉的鑒定能力。方法 對169株曲霉臨床分離株分別進行ITS、BenA和CaM序列測定，并在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析以獲得其菌種鑒定信息。結(jié)果 169株曲霉經(jīng)ITS、BenA和CaM序列分析分別有52.7%、66.3%、97.6%菌株鑒定至種水平，47.3%、33.7%、2.4%菌株鑒定至屬水平，3個序列對曲霉均不存在無法鑒定情況。結(jié)論 ITS、BenA和CaM均可用于曲霉菌種鑒定，其中以CaM的鑒定能力最強。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)；β-微管蛋白基因 (BenA)；鈣調(diào)蛋白基因 (CaM)；序列分析；曲霉；菌種鑒定

隨著罹患自身免疫病、艾滋病、腫瘤等惡性疾病患者數(shù)量的不斷增多，侵襲性曲霉病在臨床的發(fā)病率也逐年升高[1-3]。曲霉種類繁多，分類復(fù)雜，不同菌種間耐藥譜存在一定差別，如土曲霉對抗真菌藥兩性霉素B天然耐藥，煙曲霉復(fù)合群中的緩慢曲霉種對大多數(shù)臨床抗真菌藥物敏感性低[4-5]。因此，準(zhǔn)確鑒定曲霉菌種對于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。目前臨床上對曲霉的分類鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，包括直接觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地以及鏡下查找特征性菌絲、孢子等結(jié)構(gòu)。該方法鑒定能力不足，且對鑒定人員的經(jīng)驗及技術(shù)要求較高[6]。近些年來，基因序列分析技術(shù)在微生物鑒定領(lǐng)域應(yīng)用越發(fā)廣泛，通過該技術(shù)能夠?qū)⑹茉嚲隃?zhǔn)確鑒定到種水平。本研究擬對目前使用較廣泛的真菌鑒定通用DNA靶標(biāo)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Internal Transcribed Spacer，ITS)以及曲霉β-微管蛋白 (β-tubulin)基因BenA和鈣調(diào)蛋白 (calmodulin)基因CaM進行曲霉鑒定能力評估，為臨床曲霉鑒定工作提供指導(dǎo)信息。

1 材料與方法

1.1 菌株

收集北京協(xié)和醫(yī)院2015年9月～2016年3月分離自臨床患者送檢標(biāo)本的曲霉 (剔除同一患者多次分離的菌株)，20%甘油低溫保存菌種。

1.2 試劑材料

真菌用沙堡弱平皿培養(yǎng)基購自英國OXOID公司，基因組DNA提取采用德國QIAGEN DNA mini Kit試劑盒，2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

曲霉培養(yǎng) 取保存的曲霉菌種以3點式點種于沙堡弱平皿，封口膜密封平皿外圍，倒置于28℃培養(yǎng)箱孵育。2～5 d后，平皿上長出絲狀菌落 (直徑2～3 cm)即可用于后續(xù)提取基因組DNA。

曲霉基因組DNA制備 生物安全柜內(nèi)用無菌接種環(huán)刮取菌絲適量，置于裝有300 μL滅菌水的微量離心管中。加入900 μL無水乙醇，混勻，靜置5 min，起滅活菌體的作用。12 000 r/min離心3 min，棄上清。底部菌絲沉淀重懸于200 μL滅菌水中，余下步驟按照QIAGEN試劑盒說明進行。提取后的基因組DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

基因擴增及測序 ITS擴增采用通用引物ITS1和ITS4，PCR反應(yīng)條件參照文獻[7]。BenA和CaM基因擴增參照文獻[8]。PCR產(chǎn)物送生物技術(shù)公司進行核酸序列測定 (由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成)。

序列比對分析 將測序得到的ITS，BenA和CaM序列分別與Genbank數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行BLAST同源序列比對，種屬信息鑒定原則如下[9]：(1)鑒定至種水平：待分析菌株與數(shù)據(jù)庫中最佳匹配種的序列相似度≥98%，且與其他種的序列相似度較最佳匹配種低≥0.8%。(2)鑒定至屬水平：待分析菌株與數(shù)據(jù)庫內(nèi)最佳匹配種的序列相似度為95%～98%；或與數(shù)據(jù)庫中同一屬內(nèi)、不同種間的序列相似度均≥98%，且彼此間相差<0.8%。(3)無法鑒定：待分析菌株與數(shù)據(jù)庫內(nèi)最佳匹配種的序列相似度<95%；或與不同屬間的序列相似度均≥95%。

受試曲霉菌種判定 綜合分析ITS，BenA和CaM序列分析結(jié)果，確定受試菌株的菌種信息。(1)明確至種水平：3個序列均鑒定至同一種水平；或1～2個序列鑒定至種水平，余下序列鑒定至屬水平。(2)鑒定至屬水平：3個序列鑒定結(jié)果指向同一屬內(nèi)不同種；或3個序列均鑒定至屬水平；或1～2個序列鑒定至屬水平，余下序列無法鑒定。(3)無法鑒定：3個序列鑒定結(jié)果指向不同屬或均無法鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 菌株信息

本研究共收集169株曲霉，分離自臨床患者呼吸道、皮膚組織、胸腹水以及傷口分泌物等標(biāo)本。全部菌株均經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，其中煙曲霉67株 (39.6%)，黃曲霉50株 (29.6%)，黑曲霉20株 (11.8%)，土曲霉10株 (5.9%)，構(gòu)巢曲霉7株 (4.1%)，雜色曲霉2株 (1.2%)，僅鑒定到曲霉屬13株 (7.8%)。

2.2 ITS、BenA和CaM對曲霉的鑒定能力

對169株曲霉分別進行ITS、BenA和CaM序列分析 (見表1)，3個序列對曲霉均不存在無法鑒定的情況。其中，ITS對曲霉的種水平鑒定率最低，僅為52.7% (89/169)，BenA對曲霉的種水平鑒定率為66.3% (112/169)，CaM對曲霉的種水平鑒定率最高，達97.6% (165/169)。導(dǎo)致3個序列對曲霉鑒定能力差異較大的原因主要表現(xiàn)在對黃曲霉、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉的鑒定上，其中CaM對3種曲霉鑒定能力高，全部菌株均被鑒定至種水平；ITS對3種曲霉鑒定能力差，絕大多數(shù)菌株僅能鑒定到屬水平；BenA在黃曲霉鑒定方面表現(xiàn)較差，但在構(gòu)巢曲霉和黑曲霉鑒定方面表現(xiàn)較佳。對于曲霉少見種，BenA和CaM的種水平鑒定率均高于ITS。

2.3 曲霉形態(tài)學(xué)鑒定與序列分析鑒定結(jié)果的比較

以3個序列分析鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對169株受試曲霉的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進行校正評估 (見表2)。其中，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的煙曲霉、土曲霉和構(gòu)巢曲霉均正確，但仍有5株煙曲霉和1株土曲霉經(jīng)形態(tài)學(xué)僅鑒定至屬水平而經(jīng)序列分析鑒定至明確種水平。分別有1株黃曲霉和1株雜色曲霉經(jīng)序列分析校正后為溜曲霉和聚多曲霉。4株塔賓曲霉和1株日本曲霉被形態(tài)學(xué)錯誤鑒定為黑曲霉。

3 討 論

近年來，隨著醫(yī)學(xué)真菌學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的病原性絲狀真菌被發(fā)現(xiàn)，并且很多環(huán)境性絲狀真菌也相繼被報道可引起某些人群發(fā)病[10-12]。曲霉作為臨床分離率最高的絲狀真菌，其種類繁多，分類復(fù)雜，不同菌種間耐藥譜多樣；并且由于患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)不同以及抗真菌藥物的治療作用，致使一些曲霉臨床分離株形態(tài)不典型甚至發(fā)生變異。因此，單純形態(tài)學(xué)鑒定往往不能解決曲霉菌種鑒定的難題。

表1 ITS、BenA和CaM對曲霉的鑒定能力 (%)

注：a.11株曲霉少見種包括4株塔賓曲霉，1株日本曲霉，1株溜曲霉，1株聚多曲霉，1株焦曲霉，1株泡盛曲霉以及2株經(jīng)3個序列分析后仍僅能鑒定到曲霉屬

表2 曲霉形態(tài)學(xué)鑒定與序列分析鑒定結(jié)果的比較

注：a.2株菌經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為曲霉，且經(jīng)3個序列分析鑒定后仍僅能鑒定到曲霉屬水平

ITS是位于真菌核糖體18S rDNA基因3’端與28S rDNA基因5’端之間的序列，具有“種間變異，種內(nèi)保守”的特征，其通用引物ITS1和ITS4能夠?qū)^大多數(shù)酵母菌和絲狀真菌進行有效擴增及序列分析，已被廣泛用作真菌分類鑒定的DNA靶標(biāo)，但其鑒定能力略弱，多將待分析菌株鑒定至屬水平或?qū)賰?nèi)復(fù)合群水平，部分菌株經(jīng)ITS可鑒定至種水平[13-14]。β-微管蛋白 (β-tubulin)和鈣調(diào)蛋白 (calmodulin)均屬于功能性蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞的多種生物代謝途徑，其編碼基因BenA和CaM的DNA序列在不同種屬微生物間差異較大，導(dǎo)致其引物通用性受限，不同菌屬間BenA和CaM引物序列多有不同[15-16]。

前期有研究表明，針對曲霉菌的分子鑒定，ITS僅能將大多數(shù)曲霉鑒定到屬水平或進一步的復(fù)合群 (complex)水平，如黑曲霉復(fù)合群、黃曲霉復(fù)合群等。進一步地，則需BenA和 (或)CaM等蛋白編碼基因?qū)?fù)合群內(nèi)菌株進行準(zhǔn)確種水平鑒定[17-18]。本研究中，通過ITS可將52.1%曲霉鑒定到種水平，余下菌株僅能鑒定至屬水平或復(fù)合群水平，如絕大多數(shù)經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為黃曲霉的菌株經(jīng)ITS鑒定，結(jié)果在黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉等黃曲霉復(fù)合群內(nèi)部菌種間無法區(qū)分。黑曲霉、塔賓曲霉、日本曲霉等黑曲霉復(fù)合群內(nèi)菌種經(jīng)ITS也不能完全鑒定到明確種水平。BenA對曲霉的鑒定能力尚可，但對黃曲霉鑒定能力較差。CaM對曲霉鑒定能力最佳，能將曲霉常見種進行準(zhǔn)確鑒定，也能對部分曲霉罕見種進行種水平鑒定。

綜上所述，本研究擬提出如下曲霉臨床分離株鑒定策略：對于經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定至曲霉屬的絲狀真菌，若需要進一步獲得其種水平信息，可使用CaM序列分析鑒定。若經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定在曲霉屬和其他菌屬間無法區(qū)分，則應(yīng)優(yōu)先考慮進行ITS序列分析，在明確屬水平信息后進一步按需選擇適合該屬菌株的高分辨率基因或序列進行種水平鑒定。

[1] Taccone FS,Van den Abeele AM,Bulpa P,et al.Epidemiology of invasive aspergillosis in critically ill patients:clinical presentation,underlying conditions,and outcomes[J].Crit Care,2015,19:7.DOI 10.1186/s13054-014-0722-7.

[2] Liao Y,Chen M,Hartmann T,et al.Epidemiology of opportunistic invasive fungal infections in China:review of literature[J].Chin Med J (Engl),2013,126(2):361-368.

[3] Kosmidis C,Denning DW.The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis[J].Thorax,2015,70(3):270-277.

[4] Krijgsheld P,Bleichrodt R,van Veluw GJ,et al.Development inAspergillus[J].Stud Mycol,2013,74(1):1-29.

[5] Samson RA,Visagie CM,Houbraken J,et al.Phylogeny,identification and nomenclature of the genusAspergillus[J].Stud Mycol,2014,78:141-173.

[6] Hettick JM,Green BJ,Buskirk AD,et al.Discrimination ofAspergillusisolates at the species and strain level by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting[J].Anal Biochem,2008,380(2):276-281.

[7] Ciardo DE,Lucke K,Imhof A,et al.Systematic internal transcribed spacer sequence analysis for identification of clinical mold isolates in diagnostic mycology:a 5-year study[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2809-2813.

[8] Emily WT Tam,Jonathan HK Chen,Eunice CL Lau,et al.Misidentification ofAspergillusnomiusandAspergillustamariiasAspergillusflavus:characterization by internal transcribed spacer,β-tubulin,and calmodulin gene sequencing,metabolic fingerprinting,and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2014,52(4):1153-1160.

[9] Schulthess B,Ledermann R,Mouttet F,et al.Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory[J].J Clin Microbiol,2014,52(8):2797-2803.

[10] Lass-Fl?rl C.The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe[J].Mycoses,2009,52(3):197-205.

[11] Masih A,Singh PK,Kathuria S,et al.Identification by molecular methods and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and antifungal susceptibility profiles of clinically significant rareAspergillusspecies in a referral chest hospital in Delhi,India[J].J Clin Microbiol,2016,54(9):2354-2364.

[12] Kontoyiannis DP,Marr KA,Park BJ,et al.Prospective surveillance for invasive fungal infections in hematopoietic stem cell transplant recipients,2001-2006:overview of the Transplant-Associated Infection Surveillance Network (TRANSNET) database[J].Clin Infect Dis,2010,50(8):1091-1100.

[13] Rittenoura WR,Ciacciob CE,Barnesb CS,et al.Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas city indoor environments[J].Environ Sci Process Impacts,2014,16(1):33-43.

[14] Schoch CL,Seifert KA,Huhndorf S,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for fungi[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(16):6241-6246.

[15] Ahmadi B,Mirhendi H,Makimura K,et al.Phylogenetic analysis of dermatophyte species using DNA sequence polymorphism in calmodulin gene[J].Med Mycol,2016,54(5):500-514.

[16] Wang H,Xiao M,Kong F,et al.Accurate and practical identification of 20Fusariumspecies by seven-locus sequence analysis and reverse line blot hybridization,and aninvitroantifungal susceptibility study[J].J Clin Microbiol,2011,49(5):1890-1898.

[17] Balajee SA,Houbraken J,Verweij PE,et al.Aspergillusspecies identification in the clinical setting[J].Stud Mycol,2007,59:39-46.

[18] Frédéric Lamoth.Aspergillusfumigatus-related species in clinical practice[J].Front Microbiol,2016,7:683.DOI 10.3389/fmicb.2016.00683.

[本文編輯] 施 慧

Evaluation of ITS,BenAandCaMin identification of clinicalAspergillus

LI Ying，XU Ying-chun

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUnionMedicalCollegeHospital,GraduateSchool,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

Objective To evaluate the internal transcribed spacer (ITS),β-tubulin gene (BenA) and calmodulin gene (CaM) sequence analysis in identification of clinicalAspergillus.Methods All 169 strains ofAspergilluscollected from clinical patients were analyzed by ITS,BenA,CaMsequencing to obtain the species information with reference to the Genbank database.Results The tested strains were identified to species level with identification rates of 52.7% (89/169),66.3% (112/169),97.6% (165/169) and to genus level of 47.3% (80/169),33.7% (57/169),2.4% (4/169) by ITS,BenAandCaM,respectively.None of the three sequence markers failed in identification ofAspergillus.Conclusion ITS,BenAandCaMcan be used to identify clinicalAspergillus.Among them,CaMis the most efficient molecular marker forAspergillusidentification.

ITS;BenA;CaM;sequence analysis;Aspergillus;identification

74-77]

李穎，女 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:bravezane@163.com

徐英春,E-mail:xycpumch@139.com

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0074-04

2016-11-22