周國(guó)運(yùn) 王 熙 曹干生 宋 燁

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學(xué)部，湖北 武漢 430014)

雙氫青蒿素對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

周國(guó)運(yùn) 王 熙1曹干生 宋 燁

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學(xué)部，湖北 武漢 430014)

目的 探討雙氫青蒿素對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用。方法 用MTT法觀察濃度為4、8、16、32、64、128、256 μmol/L的雙氫青蒿素對(duì)三種不同的肺癌細(xì)胞SPC-A-1、Calua-3、PC-14作用48 h的增殖抑制作用，同樣用MTT檢測(cè)29 μmol/L的雙氫青蒿素作用時(shí)間為12、24、48、72、96 h后的肺癌細(xì)胞增殖情況，經(jīng)DNA ladder和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 雙氫青蒿素對(duì)三種肺癌細(xì)胞的抑制率從大到小依次為：SPC-A-1、PC-14、Calua-3。肺癌細(xì)胞SPC-A-1在雙氫青蒿素的作用下細(xì)胞抑制率較PC-14、Calua-3肺癌細(xì)胞大，利用軟件計(jì)算出細(xì)胞SPC-A-1、PC-14、Calua-3的IC50分別為28.9、46.9、78.6 μmol/L。雙氫青蒿素作用時(shí)間為12、24、48、72和96 h的細(xì)胞抑制率較0 h差異顯著(P<0.01)。說明隨著作用時(shí)間的加長(zhǎng)，抑制增殖效果越強(qiáng)。29 μmol/L的雙氫青蒿素作用48 h后的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的類似梯子樣條帶，說明雙氫青蒿素可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，經(jīng)藥物作用后的SPC-A-1細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，這表明雙氫青蒿素抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所引起的。結(jié)論 雙氫青蒿素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制肺癌細(xì)胞增殖分化。

雙氫青蒿素；肺癌細(xì)胞；凋亡；增殖

傳統(tǒng)的治療肺癌的方法主要有手術(shù)治療和化療，療效有限，而且手術(shù)治療對(duì)患者身體狀況要求較高，化療會(huì)損害人體正常的組織細(xì)胞〔1〕。青蒿素是從菊科蒿屬黃花蒿莖葉中提取的一種內(nèi)酯類〔2〕。有研究表明，中藥青蒿素除了具有抗瘧等作用外，還具有抗腫瘤的作用，相比于傳統(tǒng)的化療，副作用小，安全性高。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物之一，在青蒿素的衍生物中活性較強(qiáng)〔3〕。已經(jīng)有研究表明，雙氫青蒿素可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究選用3種不同的肺癌細(xì)胞系SPC-A-1、Calua-3、PC-14，通過噻唑藍(lán)(MTT)法選出最為敏感細(xì)胞系，經(jīng)DNA ladder瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙氫青蒿素與肺癌細(xì)胞凋亡作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人肺癌細(xì)胞系SPC-A-1、Calua-3、PC-14購(gòu)于上海生化所細(xì)胞庫(kù)。主要儀器及試劑：水浴鍋：長(zhǎng)沙基隆儀器儀表有限公司，超凈工作臺(tái)：蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司，酶標(biāo)儀：賽飛(中國(guó))有限公司，倒置顯微鏡：日本尼康，流式細(xì)胞儀：杭州聯(lián)科生物科技有限公司，離心機(jī)：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，青鏈霉素、RPMI1640、胰蛋白酶：美國(guó)Sigma，PBS：鼎國(guó)生物試劑有限公司，胎牛血清(FBS)：上海易利生物科技有限公司，雙氫青蒿素：山東新華制藥有限公司，碘化丙啶(PI)：鼎國(guó)生物試劑有限公司，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V：鼎國(guó)生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制作用 肺癌細(xì)胞用含10%FBS的PRMI-1640細(xì)胞生長(zhǎng)液培養(yǎng)，放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化并傳代。

1.2.1.1 雙氫青蒿素濃度對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響 根據(jù)細(xì)胞不同，將細(xì)胞分為3組，觀察1組細(xì)胞為SPC-A-1；觀察2組細(xì)胞為Calua-3；觀察3組細(xì)胞為PC-14。取含有胰蛋白酶含量為0.25%的消化液消化3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層肺癌細(xì)胞，用10%FBS的RPMI 1640細(xì)胞生長(zhǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔6×103個(gè)，每孔加入細(xì)胞生長(zhǎng)液100 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的雙氫青蒿素，濃度分別為4、8、16、32、64、128、256 μmol/L，每組樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立陰性對(duì)照組，在陰性組中加入等量的二甲基亞砜(DMSO)代替雙氫青蒿素，在空白組中加等量藥物但不加細(xì)胞，放置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)48 h后，加入體積20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4 h，小心倒掉上清，在沉淀中加入150 μl的DMSO，持續(xù)10 min，觀察結(jié)晶物充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為490 nm處檢測(cè)每個(gè)孔的光吸收值(OD)，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞存活率。

1.2.1.2 雙氫青蒿素作用時(shí)間對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響 接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按每孔200 μl，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為每孔6×103個(gè)，37℃，培養(yǎng)24 h，加入濃度為29 μmol/L的雙氫青蒿素，同時(shí)設(shè)置陰性組和空白組，設(shè)置方法同1.2.1.1，分別經(jīng)過12、24、48、72和96 h作用時(shí)間后，用MTT法測(cè)量計(jì)算細(xì)胞的抑制率，測(cè)量及計(jì)算方法同1.2.1.1。

1.2.2 雙氫青蒿素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用

1.2.2.1 DNA ladder 檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)期的SPC-A-1細(xì)胞與雙氫青蒿素濃度為29 μmol/L藥物相互作用，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中不加藥物，只加等量的DMSO(濃度為0.1%)，37℃，孵育48 h，收集細(xì)胞。在細(xì)胞中加入600 μl細(xì)胞裂解液后轉(zhuǎn)移至離心管中，冰浴1 h待細(xì)胞完全裂解后，12 000 r/min離心5 min，用平衡酚、酚/氯仿及氯仿分別抽提，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇及0.1 mol/L的Nacl(使其終濃度為0.2 mmol/L)，在-20℃放置1 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入TE 10 μl和2 μl 濃度為10 mg/ml的RNase充分溶解。提取的DNA ladder經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后觀察并拍照。

1.2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)SPC-A-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入29 μmol/L的雙氫青蒿素，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組不加雙氫青蒿素，加入0.1%DMSO，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清液，加入預(yù)冷的PBS 1 ml懸浮細(xì)胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，用PBS重復(fù)洗滌1次，用Binding Buffer 200 μl重懸細(xì)胞，同時(shí)加入5 μl PI和10 μl Annexin-V，放置于室溫下，避光反應(yīng)15 min 后加入300 μl的緩沖液后，立即檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 雙氫青蒿素濃度對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 隨著雙氫青蒿素的濃度的增大，3種不同的肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞存活率明顯下降，雙氫青蒿素3種肺癌細(xì)胞的抑制率從大到小依次為：SPC-A-1、PC-14、Calua-3。肺癌細(xì)胞SPC-A-1在雙氫青蒿素的作用下細(xì)胞抑制率較PC-14、Calua-3大，利用軟件計(jì)算出細(xì)胞系SPC-A-1、PC-14、Calua-3的IC50分別為28.9、46.9、78.6μmol/L。見圖1。

圖1 雙氫青蒿素對(duì)肺癌細(xì)胞SPC-A-1、Calua-3、 PC-14增殖的影響

2.2 雙氫青蒿素作用時(shí)間對(duì)肺癌細(xì)胞的影響 雙氫青蒿素作用時(shí)間為12、24、48、72、96 h的細(xì)胞抑制率〔(0.21±0.03)、(0.28±0.02)、(0.47±0.06)、(0.62±0.07)、(0.73±0.09)〕較0 h(0)差異顯著(P<0.01)。說明隨著作用時(shí)間的加長(zhǎng)，抑制增殖效果越強(qiáng)。

2.3 DNA ladder 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞凋亡時(shí)DNA在核小體間斷裂，形成的DNA片段，提取純化后，凝膠電泳呈現(xiàn)很多條帶。肺癌細(xì)胞SPC-A-1與雙氫青蒿素作用后，提取其DNA，瓊脂糖凝膠電泳后，與對(duì)照組相比出現(xiàn)很多條大小不同的亮帶，證明藥物作用后的SPC-A-1細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)藥物作用后的SPC-A-1細(xì)胞的凋亡率(0.59±0.12)較對(duì)照組(0.18±0.03)顯著增高(P<0.01)，這表明雙氫青蒿素抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增殖主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所引起的。

圖2 經(jīng)雙氫青蒿素作用后的SPC-A-1細(xì)胞DNA ladder

3 討 論

雙氫青蒿素是由四氫硼鈉還原青蒿素而產(chǎn)生的，其結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特。雙氫青蒿素具有抗腫瘤的作用，又因其安全無毒，成為近年來抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)〔4〕。本研究結(jié)果表明，SPC-A-1、Calua-3、PC-14在雙氫青蒿素的作用下細(xì)胞存活率都有明顯的下降，隨著雙氫青蒿素濃度的增加。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡是主動(dòng)的過程〔5～7〕。雙氫青蒿素對(duì)肺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。細(xì)胞凋亡時(shí)，會(huì)形成非常多的DNA片段，這些DNA片段是由DNA核小體間斷裂形成的，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后會(huì)出現(xiàn)類似梯子一樣的條帶，是判斷細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究證明肺癌細(xì)胞經(jīng)雙青蒿素作用后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了雙青蒿素可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 Annexin-V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸能親和結(jié)合，在正常的細(xì)胞內(nèi)，磷脂酰絲氨酸(PS)只存在于細(xì)胞膜脂質(zhì)內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡早期，PS通過脂質(zhì)內(nèi)側(cè)逐漸向外側(cè)翻，最終會(huì)暴露于細(xì)胞外側(cè)，而Annexin-V會(huì)在細(xì)胞凋亡早期與暴露于細(xì)胞外側(cè)的PS結(jié)合，因此其是一種檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的非常靈敏的指標(biāo)〔8～10〕。熒光標(biāo)記的Annexin-V與PI雙染色，經(jīng)顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察，可以觀察細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡情況〔11〕。PC-A-1細(xì)胞與雙氫青蒿素作用后，經(jīng)Annexin-V與PI雙染色，結(jié)果更有力的證明了雙氫青蒿素主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖。

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〔2016-12-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

湖北省自然科學(xué)基金資助(No.2012FKB04450)

周國(guó)運(yùn)(1967-)，男，副主任藥師，主要從事中藥材鑒別、炮制及中藥制劑研發(fā)研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)08-1874-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.022

1 武漢市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科