莫鎮(zhèn)濤 李文娜 翟玉榮 石京山 龔其海

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 519041)

淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞單胺類(lèi)遞質(zhì)含量的影響

莫鎮(zhèn)濤 李文娜 翟玉榮 石京山1龔其海1

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 519041)

目的 研究淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞單胺類(lèi)遞質(zhì)紊亂的調(diào)節(jié)作用。方法 采用PC12細(xì)胞氧糖剝奪(2 h)損傷模型，將10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷預(yù)給藥1 h加氧糖剝奪期間給藥2 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液的去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量。結(jié)果 10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷均能顯著升高氧糖剝奪PC12細(xì)胞上清液的NE、DA、5-HT含量和細(xì)胞的活力(P<0.05)。結(jié)論 淫羊藿苷保護(hù)氧糖剝奪PC12細(xì)胞的作用可能與調(diào)節(jié)單胺類(lèi)遞質(zhì)紊亂有關(guān)。

淫羊藿苷；PC12細(xì)胞；去甲腎上腺素；多巴胺；5-羥色胺

淫羊藿為小檗科淫羊藿Epimedium L植物，具有“溫腎壯陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕”的功效，常用于治療陽(yáng)痿，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，拘攣麻木，半身不遂等證。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一。近年研究表明，淫羊藿苷對(duì)腦缺血性損傷具有顯著的治療作用〔1～3〕，但具體作用機(jī)制尚不完善。單胺類(lèi)遞質(zhì)紊亂參與了腦缺血性損傷過(guò)程，因此本課題單胺類(lèi)遞質(zhì)的角度出發(fā)，觀察淫羊藿苷對(duì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 PC12細(xì)胞為崔國(guó)禎博士惠贈(zèng)；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、0.25%胰酶均為Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板為 Corning公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)：0914B50、批號(hào)：0929SJB；大鼠NE(批號(hào)：BI140724123)、大鼠DA(批號(hào)：BI140722023)及5-HT ELISA試劑盒(批號(hào):BI140723059)均為廣州市佰而林生物科技有限公司公司產(chǎn)品；尼莫地平注射液為德國(guó)拜耳公司產(chǎn)品，批號(hào)：BXa2EV1；淫羊藿苷為南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，純度HPLC檢測(cè)為98.3%，淫羊藿苷用DMSO配成10-3mol/L溶液于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用時(shí)用Earle平衡鹽溶液和細(xì)胞完全培養(yǎng)液分別配制成10-7、10-6、10-5mol/L藥液；Earle平衡鹽溶液配制：各藥品濃度為116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，0.9 mml/L CaCl2和10 mg/L酚紅；細(xì)胞完全培養(yǎng)液：5%胎牛血清+5%馬血清+90% DMEM高糖培養(yǎng)液。

1.2 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(HF90)、三氣培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，HF100)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，KDC-140HR)、恒溫箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DHP-9012)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Themo scientific公司，Multiskan Mk3)；萬(wàn)分之一天平(德國(guó)賽多利斯公司，BSA124S)。

1.3 方法

1.3.1 造模 PC12細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，用含5%的胎牛血清和5%的馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)液3～5 ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶并放置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，用0.25%胰酶消化，調(diào)成細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，每孔100 μl接種于96孔板；5×105個(gè)/ml，每孔1 ml接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分成6組，正常組和模型組加入完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入含10 μmol/L 尼莫地平的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，淫羊藿苷低、中、高劑量組分別加入含10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，除正常組外，其余各組吸棄含藥完全培養(yǎng)基，模型組加入Earle平衡鹽溶液，陽(yáng)性對(duì)照組加入含10 μmol/L 尼莫地平的Earle平衡鹽溶液，淫羊藿苷高、中、低劑量組分別加10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的Earle平衡鹽溶液，并放入通有1%O2，5%CO2和94%N2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞用于MTT檢測(cè)，6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，取其細(xì)胞培養(yǎng)上清液(即氧糖剝奪后的Earle平衡鹽溶液)用于ELISA檢測(cè)。

1.3.2 MTT檢測(cè) 每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT的完全培養(yǎng)液，放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO,置微量振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm的OD值。

1.3.3 ELISA檢測(cè) 每孔取100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于檢測(cè)NE、DA、5-HT。檢測(cè)方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后在450 nm測(cè)定其OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞活力的影響 與正常組比較，造模后細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高氧糖剝奪PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞NE的影響 與正常組比較，造模后細(xì)胞上清液NE、DA及5-HT含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細(xì)胞上清液NE、DA及5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3 淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞DA的影響 與正常組比較，造模后細(xì)胞上清液DA含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細(xì)胞上清液DA含量(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷對(duì)PC12細(xì)胞活力、細(xì)胞上清液NE、DA及5-HT含量的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

2.4 淫羊藿苷對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞5-HT的影響 與正常組比較，造模后細(xì)胞上清液5-HT含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細(xì)胞上清液5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

3 討 論

NE、DA、5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的單胺類(lèi)遞質(zhì)，在維持大腦正常的生理功能方面起著重要作用。腦內(nèi)NE具有調(diào)節(jié)體溫、注意力、意識(shí)、警覺(jué)、睡眠-覺(jué)醒、焦慮和疼痛、學(xué)習(xí)和記憶、情緒、內(nèi)分泌、心血管系統(tǒng)功能等〔4〕。腦內(nèi)DA具有調(diào)節(jié)軀體活動(dòng)、行為、意志、認(rèn)知與情感、睡眠-覺(jué)醒、內(nèi)分泌的作用〔5〕。腦內(nèi)5-HT具有調(diào)節(jié)認(rèn)知能力、意志、行為、焦慮和疼痛、精神情緒、聽(tīng)覺(jué)、內(nèi)分泌、體溫、睡眠等功能〔6〕。

NE、DA、5-HT等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)參與了腦缺血損傷過(guò)程，但這些單胺類(lèi)遞質(zhì)在腦缺血中的作用，目前的研究結(jié)果存在分歧〔7〕。持“單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)損傷作用”觀點(diǎn)的學(xué)者認(rèn)為，NE、5-HT等通過(guò)發(fā)揮血管活性作用，使血管收縮，加重了腦血水和腦水腫〔8〕，促使神經(jīng)元內(nèi)鈣超載，介導(dǎo)神經(jīng)元壞死〔9〕。DA通過(guò)介導(dǎo)興奮性氨基酸作用，代謝后生成自由基等產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用〔10,11〕。持“單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)保護(hù)作用”觀點(diǎn)的學(xué)者觀察到，損害腎上腺素的中樞核團(tuán)藍(lán)斑時(shí)可加重缺血性腦損傷〔12〕；增加NE釋放的藥物能明顯抑制腦缺血后海馬及新皮層神經(jīng)元壞死，而抑制NE生成的藥物則使海馬和紋狀體神經(jīng)元損傷顯著加劇〔13〕。5-HT1A 受體激動(dòng)劑能使細(xì)胞膜超極化，對(duì)抗缺血引起的神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載〔14〕。

PC12細(xì)胞是一種來(lái)自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的克隆細(xì)胞系。加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子(培養(yǎng)基中加入的胎牛血清，具有神經(jīng)生長(zhǎng)因子)后，PC12細(xì)胞分化為交感神經(jīng)元樣細(xì)胞，呈現(xiàn)神經(jīng)元樣的形態(tài)和功能〔15〕。因其具可傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，已被廣泛用于神經(jīng)藥理學(xué)的研究〔16,17〕。因此本課題采用PC12細(xì)胞作為體外缺血性腦損傷的研究材料。

尼莫地平注射液是鈣離子通道的拮抗藥，常用于治療缺血性腦損傷，臨床療效顯著，所以采用尼莫地平作為陽(yáng)性對(duì)照藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷對(duì)NE、DA、5-HT作用的量效關(guān)系不明顯，原因可能是這三個(gè)濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞活力差別不大，所以對(duì)這些指標(biāo)的量效關(guān)系不明顯。本研究結(jié)果顯示，正常PC12細(xì)胞的上清液有一定的NE、DA、5-HT含量，它們?cè)诰S持細(xì)胞的正常生理功能起著重要的作用。PC12細(xì)胞氧糖剝奪后，細(xì)胞上清液的NE、DA、5-HT含量顯著下降，原因可能是氧糖剝奪后細(xì)胞能量代謝障礙〔18〕，單胺類(lèi)遞質(zhì)的合成和釋放受到抑制。而淫羊藿苷和尼莫地平給藥后，氧糖剝奪PC12細(xì)胞的NE、DA、5-HT的含量與模型組比較，顯著升高，表明淫羊藿苷可能通過(guò)減輕鈣離子超載，減輕細(xì)胞損傷，進(jìn)而顯著恢復(fù)NE、DA、5-HT的合成和釋放作用。

1 Hu HQ,Zhou YH,Cao BZ,etal.Inhibitory effect of icariin on expression of myclin inhibitory factors in the central nervous system of rats with focal cerebral ischemia〔J〕.Neural Regen Res,2010;5(16):1211-5.

2 Zhu HR,Wang ZY,Zhu XL,etal.Icariin protects against brain injury by enhancing SIRT1-dependent PGC-1alpha expression in experimental stroke〔J〕.Neuropharmacology,2010;59(1-2):70-6.

3 馬 立，吳明華，韓 漾，等.淫羊藿苷對(duì)急性大腦中動(dòng)脈梗死大鼠SDF-1及其受體CXCR-4的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)急癥，2014;23(5):821-2.

4 王 丹.下丘腦室旁核內(nèi)的去甲腎上腺素在壓力感受性反射調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制探討〔D〕.延吉：延邊大學(xué)，2013.

5 張國(guó)炳，陳峻嚴(yán).腦內(nèi)多巴胺受體的分布和功能〔J〕.中國(guó)校醫(yī)，2013;27(1)：38-9.

6 袁偉杰，陳峻嚴(yán).腦內(nèi)5-羥色胺受體的分布和功能〔J〕.國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2011;38(6)：564-6.

7 何 治，袁 丁，姚 嵐.單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)與腦缺血關(guān)系研究進(jìn)展〔J〕.江蘇醫(yī)藥,2011；37(10)：1186-8.

8 Kiray M,Bagriyanik HA,Pekcetin C,etal.Protective effects of deprenyl in transient cerebral ischemia in rats〔J〕.Chin J Physiol,2008;51(5):275-81.

9 Wang Y,Chang CF,Morales M,etal.Diadenosine tetraphosphate protects against injuries induced by ischemia and 6-hydroxy dopamine in rat brain〔J〕.J Neurosci,2003;23(21):7958-65.

10 Surmeier DJ,Ding J,Day M,etal.D1 and D2 dopamine receptor modulation of striatal glutamatergic signaling in striatal medium spiny neurons〔J〕.Trends Neurosci,2007;30(5):228-35.

11 Seif-El-Nasr M,Atia AS,Abdelsalam RM.Effect of MAO-B inhibition against ischemia-induced oxidative stress in the rat brain.Comparison with a rational antioxidant〔J〕.Arzneimittelforschung,2008;58(4):160-7.

12 Debeir T,Marien M,Ferrario J,etal.In vivo upregulation of endogenous NGF in the rat brain by the alpha2-adrenoreceptor antagonist dexefaroxan:potential role in the protection of the basalocortical cholinergic system during neurodegeneration〔J〕.Exp Neurol,2004;190(2):384-95.

13 Muralikrishna Adibhatla R,Hatcher JF.Phospholipase A2,reactive oxygen species and lipid peroxidation in cerebral ischemia〔J〕.Free Radic Biol Med,2006;40(3):376-87.

14 Gavrilov SS,Kulinski VI.5-hydroxytryptamine and 5-methoxytryptamine increase tolerance to global cerebral ischemia〔J〕.Eksp Klin Farmakol,2007;70(6):17-8.

15 Greene LA,Tischler AS.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1976;73(7):2424-8.

16 王占強(qiáng)，賈春紅，魯 楊，等.二氮嗪對(duì)氧糖剝奪后PC12細(xì)胞凋亡及對(duì)Bcl-2蛋白的影響〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010;26(7):930-3.

17 李延紅，周占業(yè)，史 齊，等.低濃度亞硝酸鈉預(yù)處理對(duì)乙醇損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011;27(7):952-7.

18 Mo ZT,Fang YQ,He YP,etal.Changes of beclin-1 dependent on ATP,〔Ca2+〕i and MMP in PC12 cells following ischemia-reperfusion injury〔J〕.Cell Biol Int,2012;36(11):1043-8.

〔2016-01-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-0927)；貴州省聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(黔科合J字LKZ〔2013〕04號(hào))；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金(F-590)；珠海市優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2015年)

龔其海(1975-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

莫鎮(zhèn)濤(1983-)，男，博士，副教授，主要從事中醫(yī)藥治療腦病機(jī)制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1852-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.013

1 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室