劉倩倩， 陽(yáng) 洪， 石勝良， 韋檸琳 ， 陳仕檢， 林保全

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響

劉倩倩1， 陽(yáng) 洪1， 石勝良2， 韋檸琳1， 陳仕檢1， 林保全1

目的 探討鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的影響。方法 采用 Aβ1-42海馬注射建立AD模型，以他克莫司(FK506)干預(yù)。用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，RT-PCR、免疫組化以及明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)海馬區(qū)MMP-9的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，AD模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退(P<0.01)，MMP-9基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和酶活性均明顯增加(P<0.05)。FK506干預(yù)后，AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，其海馬區(qū)MMP-9基因轉(zhuǎn)錄減少、酶活性降低(P<0.05)。結(jié)論 抑制CaN激活可改善AD癥狀，可能與影響MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

阿爾茨海默??； 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD)是以認(rèn)知功能減退及行為學(xué)改變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要的病理學(xué)特點(diǎn)是神經(jīng)原纖維纏結(jié)、細(xì)胞外淀粉樣老年斑的形成、突觸損傷、神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)亡等。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一種活性受Ca2+/CaM調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它能上調(diào)細(xì)胞因子及炎癥因子活性，在大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元中表達(dá)最為豐富，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)甚微。CaN也可參與神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放以及突觸可塑性調(diào)節(jié)，其抑制劑已廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管、器官移植后抗排斥反應(yīng)等治療。Hong[1]等研究發(fā)現(xiàn)CaN抑制劑FK506可穿透血腦屏障，影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)表達(dá)，并減少AD大鼠中β淀粉樣蛋白(Amyloid protein，Aβ)的沉積。FK506也可抑制氧化應(yīng)激、維護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整而發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]，但其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過FK506腹腔注射干預(yù)，觀察大鼠行為學(xué)改變及海馬區(qū)MMP-9的表達(dá)來探討CaN作用于AD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康SD雄性大鼠36只；體重220～250 g,3～4月齡(由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；Aβ1-42(美國(guó)sigma，用前先溶于PBS，前3 d 37℃孵育，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài))；FK506(美國(guó)Selleckchem)；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Takara)；兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體；SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 36只大鼠隨機(jī)分為AD模型組、FK506處理組及對(duì)照組(每組12只)。麻醉大鼠后平顱位固定于腦立體定向儀上。參照包新民所著的大鼠腦立體定位圖譜，確定兩側(cè)海馬坐標(biāo):前囟后3 mm,正中矢狀縫左右旁開2 mm,硬腦膜下3.5 mm。按上述位點(diǎn)鉆孔后，每側(cè)海馬注射5μl Aβ1-42，10 min內(nèi)注完，并留針5min以保證藥物充分彌散。設(shè)0.01 mol PBS注射作為對(duì)照組。之后進(jìn)行藥物干預(yù)。對(duì)照組和模型組按0.2 mg/100 g腹腔注射生理鹽水；FK506組按0.2 mg/100 g注射FK506，隔日一次，共30 d。

1.2.2 大鼠行為學(xué)觀察 應(yīng)用Morris水迷宮系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行定向航行和空間搜索實(shí)驗(yàn)。前5 d，每只大鼠分別從4個(gè)不同象限入水，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)(目標(biāo)象限距水面下2 cm處)所需時(shí)間(逃避潛伏期)，取4次平均值作為每天的逃避潛伏期。若120 s內(nèi)未找到平臺(tái),則由助手幫助其上平臺(tái)。第6天撤去平臺(tái),將大鼠放入平臺(tái)所在對(duì)角線的象限內(nèi),記錄2 min內(nèi)大鼠穿過隱匿平臺(tái)次數(shù)以及在目標(biāo)象限游泳時(shí)間來評(píng)價(jià)小鼠記憶成績(jī)指標(biāo)。

1.2.3 RT-PCR 各組隨機(jī)選取6只，迅速分離左側(cè)海馬，參照RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后(37 ℃孵育15 min；85 ℃孵育5 s，4 ℃終止反應(yīng))，進(jìn)行擴(kuò)增，MMP-9：上游引物5’-GATCAGCCGGGAACGTATCT-3’；下游引物5’-TTCACCCGGTTGTGGAAACT-3’，產(chǎn)物：198 bp。GAPDH:上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’；下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,產(chǎn)物：135 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。表達(dá)量的多少通過內(nèi)參GAPDH比較來反映。

1.2.4 免疫組化染色 各組剩余6只，經(jīng)心臟灌注生理鹽水沖洗和多聚甲醛固定后取腦，常規(guī)石蠟包埋切片，取海馬冠狀層面行免疫組化染色，DAB顯色。MMP-9抗體的濃度為1∶75。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。每個(gè)標(biāo)本取2張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的海馬視野區(qū)高倍鏡下觀察，應(yīng)用IPP6.0軟件測(cè)定其積分光密度值(IOD)和陽(yáng)性面積(area)，計(jì)算平均積分光密度(IOD/area)。

1.2.5 明膠酶譜法 取各組剩余6只右側(cè)海馬，參照MMP Zymograph assay Kit試劑說明書檢測(cè)MMP-9活性。凝膠經(jīng)雙色紅外成像系統(tǒng)拍攝記錄，采用Quantity one 軟件計(jì)算條帶灰度值，并以此來反映酶活性高低。

2 結(jié) 果

2.1 定向航行及空間搜索實(shí)驗(yàn) 前5 d各組大鼠搜索平臺(tái)的平均潛伏期均逐日縮短；AD組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組及FK506組明顯延長(zhǎng)，而穿越隱匿平臺(tái)的次數(shù)及在目標(biāo)象限游泳時(shí)間明顯減少 (P<0.05) (見表1)。

2.2 RT-PCR結(jié)果 AD模型組MMP-9的mRNA表達(dá)量為(1.39±0.19)，與FK506處理組(1.00±0.42) 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組為(0.93±0.16)，與AD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 免疫組化結(jié)果 免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞顯色為胞漿或胞膜染為棕黃色或棕褐色。AD組MMP-9蛋白的IOD/area為(0.21±0.02)，F(xiàn)K506組為(0.18±0.02)，兩組比較無(wú)顯著性差異。對(duì)照組為 (0.14±0.01)，與AD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

2.4 明膠酶譜結(jié)果 AD模型組MMP-9酶活性為(2.28±0.88)，對(duì)照組為(0.57±0.09)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FK506組為(1.58±0.31)，與AD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較±s)

AD組與對(duì)照組比較*P<0.01；FK506組與AD組比較#P<0.05,△P<0.01；FK506組與對(duì)照組比較P<0.05

圖1 各組大鼠海馬區(qū)MMP-9表達(dá)的改變(×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)MMP-9酶活性的改變

3 討 論

AD是由多因素引起，涉及多種病理機(jī)制，并有多種病理表現(xiàn)的“多因異質(zhì)性疾病”。腦內(nèi)Aβ代謝異常并過度沉積后，通過一系列瀑布樣放大效應(yīng)，對(duì)腦細(xì)胞造成毒性作用，引起神經(jīng)元及突觸功能失調(diào)，另外沉積的Aβ作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，從而加強(qiáng)或促進(jìn)AD的病理過程。本研究采用雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型，與側(cè)腦室注射相比，避免了聚集態(tài)的Aβ1-42在海馬區(qū)擴(kuò)散不均、模型成功率低等缺點(diǎn)。而通過水迷宮實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)AD組大鼠較正常對(duì)照組穿越平臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)及在目標(biāo)象限游泳時(shí)間明顯減少，說明本實(shí)驗(yàn)AD大鼠造模成功。

MMPs屬于含有Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶家族，能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)。也是目前在腦脊液中發(fā)現(xiàn)的與Aβ代謝密切相關(guān)的重要金屬酶[3]。MMP-9作為一種明膠酶，在AD患者海馬區(qū)，特別是淀粉樣斑塊聚集的星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍表達(dá)豐富。MMP-9能降解Aβ[4]，但同時(shí)降解細(xì)胞外基質(zhì)、髓鞘堿性蛋白、層粘連蛋白等，并能破壞血腦屏障的完整性，從而加重AD患者的大腦損傷。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還參與調(diào)節(jié)突觸可塑性[5]、細(xì)胞調(diào)亡[6]等過程。而本研究通過RT-PCR、免疫組化及免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD組大鼠海馬區(qū)MMP-9在基因或蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯增高，說明MMP-9在AD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[7]，敲除MMP-9基因后，可防止因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血腦屏障破壞，而氧化應(yīng)激損傷可加重AD的病理過程。Lorenzl等[8]通過明膠酶譜技術(shù)也發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中MMP-9表達(dá)明顯增高。從而，我們可以推測(cè)MMP-9可能作為早期診斷AD的重要分子生物學(xué)指標(biāo)。

研究認(rèn)為，Aβ的異常產(chǎn)生和蓄積影響細(xì)胞膜上的AMPA、NMDA等鈣離子通道以及谷氨酸受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多和IP3生成，它們可作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RyR和IP3R3而導(dǎo)致鈣離子大量流入細(xì)胞質(zhì)，從而激活CaN[9]，CaN活化后去磷酸化激活活化T細(xì)胞核因子 (nuclear factor of activated T cells,NFAT)，然后NFAT進(jìn)入細(xì)胞核開始轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)一系列的生理病理反應(yīng)，包括tau蛋白的去磷酸化[10]、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡等。而MMP-9基因可結(jié)合NFTA多個(gè)位點(diǎn)[11]。本研究中，急性給予FK506干預(yù)后，與AD組大鼠相比，其穿越平臺(tái)潛伏期明顯縮短，而穿越隱匿平臺(tái)次數(shù)及在目標(biāo)象限游泳時(shí)間增多，說明抑制CaN活性可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)FK506組中MMP-9基因產(chǎn)物及酶活性較AD組降低，說明CaN可能通過上調(diào)MMP-9的表達(dá)從而緩解AD癥狀。但是FK506組較對(duì)照組大鼠MMP-9表達(dá)有增加，可能與MMP-9參與降解Aβ，或者FK506尚不能完全逆轉(zhuǎn)神經(jīng)功能損傷，這與Hong[1]等人的研究結(jié)果一致，因此，我們?nèi)孕璐髽颖镜膶?shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說明，抑制CaN激活可能通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)而改善AD癥狀，但其作用于AD的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。對(duì)各組大鼠Aβ、CaN活性的測(cè)定以及其他MMPs家族成員的檢測(cè)可能更有助于我們了解其作用于AD 的機(jī)制，從而找到新的神經(jīng)保護(hù)性藥物。

[1]Hong HS,Hwang JY,Son SM,et al.FK506 reduces amyloid plaque burden and induces MMP-9 in AbetaPP/PS1 double transgenic mice[J].J Alzheimers Dis,2010,22(1):97-105.

[2]蔡志友,晏 勇,晏 寧,等.鹽酸多奈哌奇對(duì)阿爾茨海默病患者血清MMP-2、MMP-9、ox-LDL的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2008,28(20):2035-2037.

[3]Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases[J].Lancet Neurol,2009,8(2):205-216.

[4]Yan P,Hu X,Song H,et al.Matrix metalloproteinase-9 degrades amyloid-beta fibrils in vitro and compact plaques in situ[J].J Biol Chem,2006,281(34):24566-24574.

[5]Mizoguchi H,Yamada K,Nabeshima T.Matrix metalloproteinases contribute to neuronal dysfunction in animal models of drug dependence,Alzheimer's disease,and epilepsy[J].Biochem Res Int,2011,2011:681385.

[6]王知非,廖達(dá)光,吳 浩,等.大鼠彌漫性腦損傷中基質(zhì)金屬蛋白酶-9通過激活鈣蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(9):1336-1338.

[7]Haorah J,Ramirez SH,Schall K,et al.Oxidative stress activates protein tyrosine kinase and matrix metalloproteinases leading to blood-brain barrier dysfunction[J].J Neurochem,2007,101(2):566-576.

[8]Lorenzl S,Buerger K,Hampel H,et al.Profiles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in plasma of patients with dementia[J].Int Psychogeriatr,2008,20(1):67-76.

[9]Woods NK,Padmanabhan J.Neuronal calcium signaling and Alzheimer's disease[J].Adv Exp Med Biol,2012,740:1193-1217.

[10]Qian W,Yin X,Hu W,et al.Activation of protein phosphatase 2B and hyperphosphorylation of tau in Alzheimer’s disease[J].J Alzheimers Dis,2011,23(4):617-627.

[11]Doller A,Akool el S,Muller R,et al.Molecular mechanisms of cyclosporin A inhibition of the cytokine-induced matrix metalloproteinase-9 in glomerular mesangial cells[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(2):581-592.

Effect of Calcineurin on learning and memory and MMP-9 of hippocampus region in rats with Alzheimer’s disease

LIUQianqian,YANGHong,SHIShengliang,etal.

(DepartmentofNeurology,FourthAffiliatedHospitalGuangxiMedicalUniversity,Guangxi545005,China)

Objective To explore the effect of calcineurin on learning and memory and MMP-9 of hippocampus region in Aβ1-42-induced AD rats.Methods AD rats were established by direct Aβ1-42injection.The learning and memory ability and the expression of MMP-9 were analyzed.Results FK506 could improve learning and memory ability,reduce the expression of MMP-9 in AD rats.Conclusions Inhibiting calcineurin may influence the expression of MMP-9,thus alleviate the AD symptom.

Alzheimer’s diseas; Calcineurin; MMP-9

1003-2754(2017)04-0339-03

2016-12-23；

2017-03-29

地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81460183)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 柳州 545005;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 540021)

石勝良，E-mail:ssl_1964@163.com

R749.1

A