衛(wèi)茹，閆靜波

(1邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺054000；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院)

CHK1和RAD51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá)及意義

衛(wèi)茹1，閆靜波2

(1邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北邢臺054000；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院)

目的 探討細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1(CHK1)和RAD51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá)及意義。方法 選取食管胃結(jié)合部腺癌組織141例份(腺癌組)及距腫物≥5 cm的胃黏膜組織作為正常胃黏膜組；同期胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組織112例份，其中低級別上皮內(nèi)瘤變44例(低級別瘤變組)，高級別上皮內(nèi)瘤變68例(高級別瘤變組)。用免疫組化法和Western blotting法檢測CHK1和RAD51蛋白在各組中的表達(dá)，并分析其與食管胃結(jié)合部腺癌患者臨床病理征特的關(guān)系。Spearman 法分析RAD51與CHK1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 CHK1和RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組和腺癌組中表達(dá)依次升高(P均<0.05)。CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌患者病理分化程度及l(fā)auren分型有關(guān)(P均<0.05)；RAD51蛋白表達(dá)與患者病理分化程度、lauren分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)；CHK1和RAD51蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.342，P<0.05)。結(jié)論 CHK1和RAD51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中呈高表達(dá)，二者在食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用。

食管胃結(jié)合部腺癌；上皮內(nèi)瘤變；細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶蛋白；RAD51蛋白

食管胃結(jié)合部腺癌是腫瘤中心位于胃食管交界(EGJ)及上下各5 cm 范圍內(nèi)的腺癌[1]，在我國河北省南部發(fā)病率較高，發(fā)病率約49.71/10萬。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1(CHK1)是細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤耐藥性等密切相關(guān)[2]。DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白RAD51是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白，能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，RAD51蛋白低表達(dá)，會(huì)造成胚胎死亡；RAD51蛋白適量表達(dá)，能修復(fù)自發(fā)性的DNA損傷；RAD51蛋白過量表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，增強(qiáng)腫瘤對放化療的耐受性[3]。2015年2月～2016年8月，我們采用免疫組化和Western blotting法檢測CHK1及RAD51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá)，探討二者在食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2005～2015年在河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院病理科食管胃結(jié)合部腺癌組織標(biāo)本，且經(jīng)過1位病理副主任醫(yī)師診斷，1位病理主任醫(yī)師復(fù)診。食管胃結(jié)合部腺癌組織141例份(腺癌組)，患者術(shù)前均無放化療，其中男93例、女48例，年齡<50歲56例，≥50歲85例。腫瘤最大直徑<4 cm 78例，≥4 cm 63例；組織學(xué)分化程度：高分化50例，中低分化91例；lauren分型：腸型85例，彌漫型56例；癌組織侵犯黏膜層或黏膜下層(早期胃癌)32例，侵及肌層或漿膜層(中晚期胃癌)109例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例；Siewert Ⅰ型6例，Siewert Ⅱ型71例，Siewert Ⅲ型64例。取141例食管胃結(jié)合部腺癌患者距腫物≥5 cm的胃黏膜組織作為正常胃黏膜組。選取同期胃黏膜上皮內(nèi)瘤變患者112例胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組織，患者男62例、女50例，年齡38～71歲，其中低級別上皮內(nèi)瘤變44例(低級別瘤變組)，高級別上皮內(nèi)瘤變68例(高級別瘤變組)。以上四組標(biāo)本分為兩份：1份經(jīng)甲醛固定，做HE和免疫組化染色；另1份放入液氮凍存，做Western blotting免疫印跡檢測。

1.2 CHK1及RAD51蛋白表達(dá)檢測方法 ①免疫組化法：CHK1及RAD51染色采用En Vision TM二步免疫組化染色方法。CHK1及RAD51蛋白在胞漿和胞核表達(dá)。根據(jù)著色強(qiáng)度的分值：無著色、著淡黃色、著棕黃色、著棕褐色分別計(jì)為0、1、2、3分。根據(jù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的分值:陽性細(xì)胞<10%、10%～24%、25%～49%、50%～74%、≥75%分別為0、1、2、3、4分。著色強(qiáng)度分值×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值計(jì)為免疫組化總分值，0～1分為陰性(-)，≥2分為陽性(+)。②Western blotting法:提取正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組和腺癌組蛋白，參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白含量，做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠內(nèi)的樣品蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5% BSA常溫振蕩封閉1 h。一抗體(CHK1及RAD51抗體)，4 ℃過夜，二抗，室溫1 h。然后加入堿性磷酸酶顯色劑顯色20 min。用掃描儀掃描NC膜上蛋白表達(dá)條帶的灰度，用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，正常胃黏膜組的平均光密度值(OD值)取值為1，其他各組與正常胃黏膜組相比取值。

2 結(jié)果

2.1 各組CHK1、RAD51蛋白表達(dá)比較 免疫組化檢測結(jié)果顯示，正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組和腺癌組CHK1蛋白陽性表達(dá)率分別為9.22%(13/142)、22.73%(10/44)、48.53%(33/68)、79.43%(112/141),RAD51蛋白陽性表達(dá)率分別為8.51%(12/142)、20.45%(9/44)、44.12%(30/68)、72.34%(102/141),四組間CHK1、RAD51蛋白陽性表達(dá)率比較，P均<0.05。

Western blotting法檢測結(jié)果顯示正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組和腺癌組CHK1蛋白相對表達(dá)量分別為1、2.40±0.11、5.39±0.37、9.01±1.52，RAD51蛋白相對表達(dá)量分別為1、2.29±0.08、4.97±0.24、8.13±1.03，四組間CHK1、RAD51蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

2.2 CHK1及RAD51蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌患者病理分化程度及l(fā)auren分型有關(guān)(P均<0.05)。RAD51蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌患者病理分化程度、lauren分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 CHK1、RAD51蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 RAD51與CHK1蛋白表達(dá)的相關(guān)性 食管胃結(jié)合部癌患者癌組織中CHK1與RAD51蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.342，P<0.05)。

3 討論

近年來，食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)病率持續(xù)升高，進(jìn)展快，約80%的患者發(fā)現(xiàn)已進(jìn)入晚期，5年生存率低于30%[4]。與胃竇癌相比，食管胃結(jié)合部腺癌較早深層胃壁浸潤、轉(zhuǎn)移[5，6]。食管胃結(jié)合部腺癌最常用的分型為Siewer分型[7]。SiewertⅠ型預(yù)后最好，SiewertⅡ型次之，SiewertⅢ型最差。在我國，SiewertⅠ型少見，而SiewertⅡ和Ⅲ型多見。肖文光等[8]研究顯示，我國的SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為3.9%、53.1%和43.0%；楊宏等[9]研究顯示，我國的SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為4.7%、50.3%和45.0%。本研究收集食管胃結(jié)合部腺癌標(biāo)本141例，SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型所占比例分別為4.3%、50.3%、45.4%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。機(jī)體細(xì)胞周期的調(diào)控是復(fù)雜精密的程序，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)蛋白質(zhì)缺失會(huì)引起細(xì)胞周期紊亂，造成基因組不穩(wěn)定，與腫瘤關(guān)系密切[10]。研究顯示，在多種腫瘤細(xì)胞中CHK1高表達(dá)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤耐藥性等方面發(fā)揮作用[2]，CHK1異常表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞周期檢測點(diǎn)對DNA損傷失去修復(fù)作用，增加機(jī)體腫瘤易感性，引起腫瘤發(fā)生。

RAD51蛋白是一種DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白，在同源重組修復(fù)中起重要作用，參與DNA損傷感應(yīng)和細(xì)胞周期關(guān)卡的復(fù)雜信號通路，通過同源重組修復(fù)，Rad 51蛋白可保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷[11]。然而，過多的RAD51蛋白又會(huì)過量引起姐妹染色體交換和同源重組，結(jié)果會(huì)引起遺傳的差異性和基因的不穩(wěn)定性，造成腫瘤細(xì)胞過多增殖和不能分化成熟，引起腫瘤發(fā)生，并造成腫瘤細(xì)胞對放化療耐藥和預(yù)后不良[12]。Rad51蛋白的關(guān)鍵肽段發(fā)生突變，會(huì)引起該基因的失活，結(jié)果引起腫瘤形成。

本研究結(jié)果顯示，CHK1和RAD51蛋白在正常胃黏膜組、低級別瘤變組、高級別瘤變組和腺癌組表達(dá)逐漸升高；CHK1和RAD51蛋白在中低分化胃腺癌的表達(dá)強(qiáng)于高分化胃腺癌。說明CHK1和RAD51蛋白可能促進(jìn)了食管胃結(jié)合部黏膜的癌變及其發(fā)生發(fā)展。在食管胃結(jié)合部腺癌的臨床病理因素中，CHK1蛋白表達(dá)與患者的病理分化程度和lauren分型有關(guān)，說明CHK1可能與食管胃結(jié)合部腺癌的惡性程度有關(guān)。隨著腫瘤的進(jìn)展，惡性程度的增高，CHK1蛋白表達(dá)升高，提示CHK1蛋白可能促進(jìn)了食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生發(fā)展。lauren分型彌漫型胃腺癌CHK1蛋白表達(dá)高于腸型胃腺癌，彌漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒細(xì)胞癌，惡性程度較高；腸型胃腺癌主要指高分化腺癌，惡性程度較低，提示CHK1蛋白在低分化食管胃結(jié)合部腺癌中表達(dá)高，CHK1蛋白可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，CHK1蛋白升高，患者預(yù)后差。本研究結(jié)果還顯示，CHK1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在食管胃結(jié)合部腺癌的臨床病理因素中，RAD51蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌的病理分化程度、lauren分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明RAD51可能是判斷腫瘤惡性程度高低及分級、分期的重要標(biāo)志。隨著腫瘤進(jìn)展，惡性程度增高，RAD51蛋白表達(dá)升高，提示RAD51蛋白可能促進(jìn)了食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生發(fā)展。RAD51蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)升高，提示RAD51蛋白可能促進(jìn)了食管胃結(jié)合部腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，RAD51蛋白表達(dá)可作為判斷食管胃結(jié)合部腺癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。食管胃結(jié)合部癌組織中CHK1和RAD51蛋白表達(dá)正相關(guān)，說明二者在食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

綜上所述，食管胃結(jié)合部癌組織中CHK1和RAD51蛋白呈高表達(dá)，二者可能共同促進(jìn)了食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生發(fā)展。

[1] Hasegawa S, Yoshikawa T, Cho H, et al. Is Adenocarcinoma of the esophagogastric junction different between Japan and western countries?The incidence and clinicopathological features at a Japanese high-volume cancer center[J]. World J Surg, 2009,33(1):95-103.

[2]Russell MR, Levin K, Rader J, et al. Combination therapy targeting the Chk1 and Wee1 kinases shows therapeutic efficacy in neuroblastoma[J]. Cancer Res, 2013,73(2):776-784.

[3] Wang Z, Dong H, Fu Y, et al. RAD51 135G>C polymorphism contributes to breast cancer susceptibility:a meta-analysis involving 26,444 subjects[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010,124(3):765-769.

[4] Siewert JR, Feith M, Stein HJ. Biologic and clinical variations of adenocarcinoma at the esophago-gastric junction:Relevance of a topographic-anatomic subclassification[J]. J Surg Oncol, 2005,90(3):139-146.

[5] Ohno S, Tomisaki S, Oiwa H, et al. Clinicopathologic characteristics and outcome of adenocarcinoma of the human gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. J Am Coll Surg, 1995,180(5):577-582.

[6] Saito H, Fukumoto Y, Osaki T, et al. Distinct recurrence pattern and outcome of adenocarcinoma of the gastric cardia in comparison with carcinoma of other regions of the stomach[J]. World J Surg, 2006,30(10):1864-1869.

[7] 薛英威，于雪峰.提高對食管胃結(jié)合部腫瘤的認(rèn)識[J].中華胃腸外科雜志，2013，16(6):125-127.

[8] 肖文光，馬可，彭林，等.食管胃交界部腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及手術(shù)方式選擇[J].中華胃腸外科雜志，2012,15(9):897-900.

[9] 楊宏，武愛文，季加孚，等.食管胃結(jié)合部腺癌471例Siewert分型臨床研究[J].中國實(shí)用外科雜志，2012,32(4):310-315.

[10]Ahmed A, Yang J, Maya-Mendoza A, et al. Pharmacological activation of a novel p53-dependent S-phase chechpoint involving CHK-1[J]. Cell Dedth Dis, 2011,19(2):160.

[11] Schild D, Wiese C. Overexpression of RAD51 suppresses recombination defects:a possible mechanism to reverse genomic instability[J]. Nucleic Acids Res, 2010,38(4):1061-1070.

[12] Shi S, Qin L, Tian M, et al. The effect of RAD51 135 G>C and XRCC2 G>A (rs3218536) polymorphisms on ovarian cancer risk among Caucasians:a meta-anlysis[J]. Tumor Biology, 2014,3(4):1-8.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.020

R735.2

B

1002-266X(2017)09-0061-03

2016-12-07)