丁忠陽，許飛，唐建東，李淦，蔣盤強，吳昊天，唐張峰

(南京中醫(yī)藥大學附屬無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無錫214071)

藤黃酸對耐藥胃癌細胞增殖、凋亡、遷移的影響及機制

丁忠陽，許飛，唐建東，李淦，蔣盤強，吳昊天，唐張峰

(南京中醫(yī)藥大學附屬無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無錫214071)

目的 探討藤黃酸對耐藥胃癌細胞增殖、凋亡、遷移的影響及機制。方法 取處于對數期的耐吉西他濱的胃癌細胞(R-MKN28)，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組和藤黃酸+IL-6組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組予藤黃酸2.0 μg/mL，藤黃酸+IL-6組在藤黃酸處理的基礎上加用IL-6 10 ng/mL 處理。用MTT、流式細胞術、Transwell和生物信息學等方法觀察藤黃酸對R-MKN28細胞增殖、凋亡和遷移的影響。并通過qRT-PCR法檢測IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達，采用ELISA法檢測IL-6蛋白表達。結果 藤黃酸干預至72 h時，Blank組492 nm處吸光度值由0 h的0.472±0.012升高到0.988±0.031，而藤黃酸組只由0 h的0.409±0.008上升至0.762±0.022，兩組比較，P<0.01。細胞凋亡檢測結果顯示，Blank組凋亡率為(14.25±1.352)%；藤黃酸組凋亡率為(23.48±1.574)%，兩組比較，P<0.05。Transwell 結果顯示，Blank組穿膜細胞數為(61.67±7.265)個/視野，而藤黃酸組穿膜細胞數為(29.68±5.487)個/視野，兩組比較，P<0.05。藤黃酸組R-MKN28細胞的IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達水平表達下降，IL-6蛋白表達減少(P均<0.05)。MTT實驗結果顯示，藤黃酸+IL-6組細胞增殖能力相比藤黃酸組在48 h后明顯上升(P<0.05)。Transwell 實驗結果顯示，藤黃酸+IL-6組穿膜細胞數為(60.00±4.619)個/視野，而藤黃酸組僅為(27.00±5.859)個/視野，兩組比較，P<0.05。生物信息學分析表明耐吉西他濱的胃癌細胞中IL-6水平表達升高。結論 藤黃酸可能通過調節(jié)IL-6水平抑制耐吉西他濱的 R-MKN28 細胞增殖和遷移，促進凋亡。

胃癌；耐藥癌細胞；藤黃酸；白細胞介素6

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率逐年上升，病死率較高。外科手術是目前最有效的治療方法，但我國胃癌的早期診斷率低，確診時大部分患者已失去手術機會；另外，50%～70%進展期胃癌患者術后可出現復發(fā)[2]?；熓且环N全身性治療手段，對潛在轉移灶和臨床已發(fā)生轉移的癌灶均有作用。因此，化療已成為患者術后輔助性治療和晚期不適于手術患者姑息治療的主要方式。但隨著化療藥物的持續(xù)治療，患者機體可產生不同程度的耐藥導致化療效果下降甚至無效[3]。在我國，中醫(yī)藥治療癌癥的方式被廣泛采用，且取得較好效果[4]。2014年9月，我們采用藤黃酸中藥單體處理胃癌耐藥細胞，觀察藤黃酸對胃癌耐藥細胞耐吉西他濱的作用，并對其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 藤黃酸粉劑(純度99%)和MTT試劑購自美國Sigma 公司，溶解分裝后保存于-20 ℃。細胞培養(yǎng)相關試劑購于美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)材料購于美國Corning公司。人胃癌耐吉西他濱細胞系R-MKN28由Saiki Y 教授饋贈，R-MKN28 細胞培養(yǎng)于含10% FBS和雙抗(100 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃含5% CO2孵箱中。TRIzol購于Invitrogen公司。PCR相關試劑購于大連寶生生物公司。IL-6的ELISA試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細胞增殖能力檢測 取對數期R-MKN28細胞傳代接種于96孔板(1×103個/孔)。待細胞貼壁后，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入100 μL溶解的藤黃酸溶液，使藤黃酸終濃度為2.0 μg/mL，此時記為0 h。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，分別于0、24、48 h和72 h加入20 μL/孔MTT試劑，放入孵箱再培養(yǎng)4 h，取出96孔板，用注射器小心吸走細胞培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，避光振搖10 min，上機于492 nm 波長處檢測每孔吸光度值(OD值)。

1.3 細胞凋亡率檢測 取對數期R-MKN28細胞接種于6孔板，細胞數為8×105個/孔。12 h細胞貼壁后，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入藤黃酸溶液，使其終濃度為2.0 μg/mL。培養(yǎng)48 h后將細胞用胰酶消化后收集至15 mL離心管，保證每個樣本細胞數≥106。用預冷PBS洗滌細胞3次。加入 Anexin V 和 PI 進行孵育(注意避光)。送實驗中心流式平臺檢測細胞凋亡率。

1.4 細胞遷移能力檢測 R-MKN28細胞接種于6孔板，細胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入藤黃酸2.0 μg/mL進行干預。24 h后將細胞胰酶消化后收集于離心管，1 000 r/min，離心3 min。PBS洗滌1次，加入無血清培養(yǎng)基重懸。細胞計數后，將400 μL共5×105個細胞加入懸掛于24孔板上的Transwell小室上室。下室為20% FBS培養(yǎng)基600 μL。24 h后取出Transwell小室，PBS洗滌2次，加入結晶紫進行染色。鏡下觀察每個小室細胞數目，并計算每個視野下細胞數目。

1.5 R-MKN28細胞中IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。R-MKN28 細胞分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入藤黃酸2.0 μg/mL進行干預。36 h后使用TRIzol提取細胞RNA。取2 μg逆轉錄為cDNA。按qRT-PCR試劑盒操作說明，依次加入模板、引物和預混SYBGREEN 等試劑進行 qRT-PCR 反應檢測基因表達，依照2-ΔΔCT計算。引物序列IL-6上游引物5′-CTCAATATTAGAGTCTCAACCCCCA-3′，下游引物5′-GAGAAGGCAACTGGACCGAA-3′；JAK1上游引物5′-GCATCGAGCGCACAAAGTTAT-3′，下游引物5′-ACCAGTAGGGTTGAGGGACA-3′；BCL2上游引物5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′，下游引物5′-ACTTGTGGCCCAGATAGGCA-3′；AKT1上游引物5′-GAAGGACGGGAGCAGGCG-3′，下游引物5′-TGTACTCCCCTCGTTTGTGC-3′。

1.6 IL-6蛋白表達檢測 采用ELISA法。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，對數生長期的 R-MKN28細胞接種于 6 孔板，每孔細胞數為5×106個。待細胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入終濃度為2.0 μg/mL的藤黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后加入裂解液進行蛋白抽提，抽提完成后加入已包被的板子，加入200 μL抗IL-6的酶標抗體，室溫放置2 h。洗滌液清洗4 次，每孔加200 μL 底物進行顯色。室溫反應20 min，每孔加入50 μL反應終止液，采用酶標儀在450 nm 處檢測。

1.7 生物信息學分析 芯片數據來源為GEO數據平臺上 GEO accession 為 GSE58118 數據 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58118)。該基因表達譜芯片數據包含4個樣本，其中2個R-MKN28細胞樣本，2 個耐吉西他濱的R-MKN28細胞樣本。芯片數據下載后對數據整理，使用斯坦福大學開發(fā)的SAM軟件對芯片數據分析，采用heatmap illustrator軟件導出熱圖。

1.8 藤黃酸處理R-MKN28后加入IL-6重組蛋白對細胞增殖和遷移能力的影響 取對數生長期的 R-MKN28細胞接種于 6 孔板，每孔細胞數為5×106個。待細胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組、藤黃酸+IL-6組，Blank組不予任何干預，藤黃酸組加入終濃度為2.0 μg/mL的藤黃酸，藤黃酸+IL-6組予藤黃酸2.0 μg/mL及重組IL-6蛋白10 ng/mL，細胞增殖能力檢測同1.2，細胞遷移能力檢測同1.4。

2 結果

2.1 藤黃酸對R-MKN28細胞增殖、凋亡及遷移的影響 加入藤黃酸后R-MKN28細胞增殖于24 h后明顯降低(P<0.05)，且至72 h此現象更明顯(P<0.01)；R-MKN28細胞凋亡增加(P<0.05)；藤黃酸組R-MKN28 細胞穿膜數數明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組細胞增殖、凋亡和遷移能力比較(±s)

2.2 藤黃酸處理后R-MKN28 細胞相關基因表達變化 qRT-PCR 結果顯示，加入藤黃酸后 R-MKN28細胞IL-6基因表達水平相比Blank組的4.333下降至1.167、JAK1相比Blank組的 2.786下降至1.133、BCL2相比Blank組的3.300下降至1.000和AKT1相比Blank組的3.300下降至0.933；藤黃酸組IL-6 蛋白表達(111.333 ng/mL)相比Blank組的(169.000 ng/mL)亦下降(P均<0.05)。

2.3 耐吉西他濱胃癌的生物信息學分析 下載 GEO 數據庫GEO accession 為 GSE58118 的基因芯片進行分析表明，耐吉西他濱胃癌細胞相比不耐藥細胞株IL-6基因水平表達明顯增高。

2.4 藤黃酸處理R-MKN28 后恢復IL-6水平對R-MKN28細胞增殖和遷移能力的影響 加入重組IL-6后R-MKN28細胞增殖和遷移能力均有不同程度恢復(P均<0.05)，見表2。

表2 各組細胞在恢復IL-6水平后增殖和遷移能力比較(±s)

3 討論

晚期胃癌是目前外科臨床研究的重點、難點。尤其是經過多重化療后，部分患者出現對常規(guī)化療方案的耐藥，治療棘手[5]。吉西他濱是一種人工合成的嘧啶類核苷藥物，其主要作用機制是干擾細胞NDA周期，為周期特異性藥物。吉西他濱目前已大范圍用于食管癌、乳腺癌和原發(fā)性肝癌等多種腫瘤的治療[6]。關于吉西他濱治療胃癌的文獻較多，其中多數研究認為吉西他濱對胃癌無明顯作用[7]。

藤黃酸為藤黃科植物分泌的干燥樹脂藤黃中主要成分。中醫(yī)古籍記載藤黃具有消炎、抑菌、止血、抗病毒等作用，常被用于膿腫、跌打損傷和各種體蘚的治療中。藤黃酸是橙黃色無定形粉末，具有光學性，相對分子質量為628.76 kD。藥理學研究表明藤黃酸具有抗腫瘤作用，可抑制多種癌癥的增殖、遷移、侵襲。藤黃酸可通過線粒體氧化應激和誘導細胞色素C的釋放來促進鼻咽癌細胞的凋亡[8]，通過將肺癌細胞周期阻滯于G0/G1期達到抑制腫瘤細胞增殖的作用[9]。本研究結果顯示，耐吉西他濱胃癌細胞R-MKN28加入藤黃酸后，細胞增殖明顯下降，且呈時間依賴性；細胞凋亡增加；細胞遷移能力降低?？梢娞冱S酸可影響耐吉西他濱的胃癌細胞生物學行為，抑制耐吉西他濱的胃癌細胞生長并促進凋亡。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現藤黃酸可降低R-MKN28細胞IL-6基因和蛋白及其下游基因水平。IL-6是一種可由多種細胞分泌的多功能因子。在多種腫瘤的宿主防御和癌細胞生長中起中心作用。在胃癌中，IL-6可通過激活c-Src/RhoA/ROCK信號通路介導胃癌的侵襲[10]。IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch 信號通路是曲妥單抗治療胃癌發(fā)揮作用的重要信號通路，亦是胃癌耐曲妥單抗的主要靶點[11]。生物信息學分析結果表明在耐吉西他濱的胃癌細胞中IL-6表達水平明顯升高，而加入藤黃酸后IL-6表達水平下降，且在使用重組IL-6后R-MKN28生物學行為又朝惡性程度方向發(fā)展。

綜上所述，雖然多數文獻報道吉西他濱不能用于胃癌治療，但此研究中我們加入了中藥單體藤黃酸后，胃癌細胞增殖、遷移能力下降，凋亡增多。此可能成為吉西他濱治療胃癌的一個突破口，但具體機制尚需深入研究。

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2015年度無錫市科技發(fā)展資金項目(CSE31N1513)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.012

R735.2

A

1002-266X(2017)09-0039-03

2016-07-01)