陳婕 張津瑋 楊巖 胡建功 李慧臻 杜瀟 王天麟 孔祥茹

實驗研究∥Experimental Study

肝郁脾虛型FD大鼠模型的建立及評價※

陳婕1張津瑋3楊巖2胡建功4李慧臻1杜瀟2王天麟2孔祥茹2

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，天津300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津300073；
3天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，天津300073)

目的建立肝郁脾虛型功能性消化不良(FD)大鼠模型。方法SD大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、胃泰組、嗎丁啉組，每組各10只。模型組采用夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法建立FD大鼠模型，用32 mm蝴蝶夾夾鼠尾后1/3處，30 min后放開，每日1次；每周予二、四、六禁食，余日給足量飼料，持續(xù)4周。觀察比較2組大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量增長情況、糖水消耗實驗、敞箱實驗(open-field法)、胃內(nèi)殘留率測定（胃排空率測定）、小腸推進(jìn)率的測定、一氧化氮（NO）、神經(jīng)降壓素（NT）、胃竇組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果大鼠逐漸出現(xiàn)精神倦怠、體重增長緩慢、糖水消耗減少、大鼠活動減少、胃內(nèi)殘留率增加/胃排空率降低、小腸推進(jìn)率降低、無炎癥細(xì)胞浸潤等病理組織學(xué)改變。結(jié)論本造模方法簡單易行，可重復(fù)率高，值得進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。

功能性消化不良；動物模型；肝郁脾虛；動物實驗研究

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是臨床上最常見的一種功能性胃腸病(functional gas-trointestinal disorders，F(xiàn)GID)，且其具有慢性、復(fù)發(fā)性和難以緩解性的特點[1]，主要表現(xiàn)為上腹部不適：胃疼、燒心、餐后不適和胃部飽脹感等，而不能通過器質(zhì)性原因來解釋這些癥狀的消化不良，也是功能性胃腸疾病(functional gastrointestinal disor-ders，F(xiàn)GID)的其中之一。FD雖然病位在胃腸，但其發(fā)病與五臟相關(guān)，其中與肝脾尤為密切，肝郁脾虛為胃腸功能紊亂的病理本質(zhì)[2]。歐美流行病學(xué)調(diào)查顯示：普通人群中患消化不良癥狀者占19%～41%，而我國發(fā)病率為20%～30%[3]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對FD發(fā)病過程中生理-心理-社會模式的重視及腦-腸軸概念的明確，精神心理因素已成為近年來研究的熱點[4]。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性SD大鼠50只，體重(250±10)g，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心，合格證編號：SCXK(京)2009-0017，置于標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下飼養(yǎng)[室溫（24±2）℃，濕度（55±5）%]。

1.2 儀器電子秤32 mm蝴蝶夾；全自動真空組織脫水機(jī)：Leica ASP300 S；組織包埋機(jī)：Leica EG1160；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)：Leica RM2235；光學(xué)顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)：OLYMPUS。

1.3 分組大鼠隨機(jī)分為4組，空白組、模型組、胃泰組、嗎丁啉組，每組10只。除空白組外，其它各組采用夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法建立FD大鼠模型。

1.4 造模方法32 mm蝴蝶夾夾鼠尾后1/3處，30 min后放開，每日1次；每周予二、四、六禁食，余日給足量飼料，持續(xù)4周。

1.5 造模成功評價標(biāo)準(zhǔn)通過大鼠的一般狀態(tài)觀察、體重增長情況、糖水消耗實驗、敞箱實驗、胃內(nèi)殘留率測定/胃排空測定、小腸推進(jìn)率測定、胃組織形態(tài)學(xué)變化判斷造模成功與否。

1.6 模型評價

1.6.1 一般狀態(tài)的觀察每日觀察大鼠神態(tài)、毛色、進(jìn)食量、排泄物性狀及體重變化等；觀察每日夾尾時，大鼠是否出現(xiàn)嘶叫、激惹、打斗、躲避、畏懼、扎堆兒、少動、神態(tài)倦怠等傾向。

1.6.2 體重增長情況動態(tài)觀察大鼠體重增長情況。

1.6.3 糖水消耗實驗大鼠禁食禁水24 h后，給予每組大鼠一瓶1%糖水(已稱質(zhì)量)，1 h后取走糖水瓶再次稱量質(zhì)量，兩次稱質(zhì)量的差值即為1%糖水?dāng)z取量，于實驗第7、14、21、28 d各稱量l次。

1.6.4 敞箱實驗(open-field法)使用自制敞箱70 cm×70 cm×40 cm，敞箱的四壁及底面均涂成黑色，底面用粉筆劃分成等面積的25個方塊。實驗時將大鼠置于敞箱底面正中的方格內(nèi)，以大鼠穿越底面的格數(shù)(三爪均踏入方格內(nèi)可計數(shù))為水平運(yùn)動的次數(shù)；以前肢離地次數(shù)(前肢騰空或攀附箱壁)為垂直運(yùn)動次數(shù)，每只大鼠在實驗第7、14、21、28 d各測定l次，3 min/次。

1.6.5 胃腸動力測定

1.6.5.1 胃內(nèi)殘留率測定（胃排空率測定）實驗前大鼠禁食不禁水12 h，用碳素墨水灌胃(l ml/100 g)，30 min后用10%水合氯醛麻醉大鼠，剖腹取胃，稱取質(zhì)量為全胃質(zhì)量，沿胃小彎側(cè)剪開胃壁，沖凈胃內(nèi)容物，濾紙吸干，稱取質(zhì)量為空胃質(zhì)量，計算胃排空率。胃內(nèi)殘留率(%)=(全胃質(zhì)量-空胃質(zhì)量)/灌入量×100%。實驗第28 d隨機(jī)抽取6只模型組大鼠、及空白組6只大鼠進(jìn)行檢測。胃排空率=[1-(全胃質(zhì)量-空胃質(zhì)量)/灌入量]×100%。

1.6.5.2 小腸推進(jìn)率的測定分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，置于白紙上，輕輕拉成直線，測量腸管長度為小腸總長度，從幽門至碳墨前沿的距離為碳墨在小腸內(nèi)推進(jìn)的距離。與胃排空率測定實驗同時檢測。小腸推進(jìn)率(%)=碳墨在小腸推進(jìn)的距離/小腸總長度×100%。

1.6.6 一氧化氮（NO）、神經(jīng)降壓素（NT）實驗第28天禁食12 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，收集于空白的采血管中，靜置30 min，4℃3000 r/min離心，20 min，取上清，為血清，供NO、NT檢測。

1.6.7 胃竇組織形態(tài)學(xué)變化各組大鼠在造模結(jié)束后及給藥干預(yù)結(jié)束后第2天，用30%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉后，采用中性甲醛，以內(nèi)固定的方法固定全胃，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察胃病理學(xué)變化。

1.6.8 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，多組數(shù)據(jù)則采用參數(shù)統(tǒng)計的單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法；自身前后比較則采用配對T檢驗。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗中的多個獨立樣本Kmskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用SNK-q法進(jìn)行統(tǒng)計處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察實驗前，各組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動，皮毛順滑光澤，眼角口鼻干凈，耳廓呈淡粉色，大便干稀適中。參與造模的大鼠，夾尾刺激后，表現(xiàn)為強(qiáng)烈的嘶叫、反抗、欲掙脫蝴蝶夾、呈激惹狀態(tài)、尋釁打斗，夾尾持續(xù)15 min后嘶叫、打斗減少，大鼠或扎堆角落，或舔蝴蝶夾，但保持激惹狀態(tài)，相互警惕，站立呈防御姿勢，造模前7 d大鼠的激惹程度隨造模時間的延長逐漸加重，并能持續(xù)至夾尾結(jié)束后。7 d后逐漸開始適應(yīng)，嘶叫、打斗時間減少，平均持續(xù)不足10 min，但仍保持激惹狀態(tài)。7 d后，大鼠逐漸出現(xiàn)精神倦怠甚至萎靡不振、易激怒、躲避、畏懼、皮毛干枯散亂無光澤、扎堆兒角落、少動、體重下降、進(jìn)食減少等。

2.2 體重增長情況如表1，夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)造模28 d后，與空白組相比，模型組大鼠體重增長緩慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法對大鼠體重的影響（x±s，g）

2.3 糖水消耗實驗如表2，夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模28 d后，與空白組相比，模型組大鼠糖水消耗減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法對大鼠糖水消耗的影響（x±s，g）

2.4 敞箱實驗(open-field法)如表3，夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模28 d后，與空白組相比，模型組大鼠活動減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法對大鼠敞箱實驗的影響（x±s，次）

2.5 胃內(nèi)殘留率測定/胃排空率測定如表4，夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模28 d后，與空白組相比，模型組大鼠胃內(nèi)殘留率增加/胃排空率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法對大鼠胃內(nèi)殘留率的影響（x±s，%）

2.6 小腸推進(jìn)率測定如表5，夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模28d后，與空白組相比，模型組大鼠小腸推進(jìn)率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法對大鼠小腸推進(jìn)率的影響（x±s，%）

2.7 胃組織形態(tài)學(xué)變化如圖，各組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)正常。粘膜上皮完整，均無充血、水腫、潰瘍，無炎癥細(xì)胞浸潤等病理組織學(xué)改變。提示夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模大鼠胃無炎性病變。

圖1 2組大鼠胃竇HE染色（×100）

3 討論

與正常組相比，模型組大鼠精神倦怠甚至萎靡不振、易激怒、躲避、畏懼、皮毛干枯散亂無光澤、扎堆兒角落、少動、體重下降、進(jìn)食減少等，體重增長緩慢，大鼠胃內(nèi)殘留率增加/胃排空率降低，小腸推進(jìn)率降低，胃無組織形態(tài)學(xué)改變。說明夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂養(yǎng)法造模復(fù)制FD成功，且造模大鼠胃無炎性病變。

夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂食造模肝郁脾虛型FD動物模型成功，操作簡便，無炎性改變。本實驗夾尾聯(lián)合不規(guī)則喂食的方法是兩因素結(jié)合制備的動物模型，同時也是中醫(yī)肝郁脾虛動物模型，該法造模簡單，所需時間短。束縛應(yīng)激結(jié)合其他方法造模能較好地模擬FD，一直是FD研究的首選。

[1]Ford AC.Eradicating Helicobacter pylori in functional dyspepsia.Gastroenterology 2012（142）:1613-1614.

[2]蘇干伸.中醫(yī)辨證治療功能性消化不良40例療效觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，29（14）:11-12．

[3]沈志祥，陳喜芝，譚詩云，等.消化系統(tǒng)疾病診斷與治療學(xué)[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2004:166.

[4]徐亮，陳劍群.功能性消化不良與精神心理因素關(guān)系的研究進(jìn)展[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，30(6):418.

Establishment and Evaluation of Liver and Spleen Deficiency FD Rats Model

CHEN Jie1,ZHANG Jinwei3,YANG Yan2,HU Jiangong4,LI Huizhen1,DU Xiao2,WANG Tianlin2,KONG Xiangru2
(1.Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300073,China; 3.Department of Neurology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 4.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

ObjectiveTo establish liver stagnation and spleen deficiency type of functional dyspepsia(FD)rat model.Methods50 SD rats were randomly divided into control group,model group,medicine group and domperidone group,with 10 rats in each group.The model group used tail clamp combined with irregular feeding method to establish the rat model of FD rat.After 1/3 32mm 30min after the release,the butterfly clip,1 time a day,two,four,six week to fasting,to more than enough feed for 4 weeks.The two groups of rats general condition,body weight growth,sugar consumption test and open field test(open-field method),the gastric remnant rate determination(determination of gastric emptying rate,intestinal propulsive rate determination),nitric oxide(NO) and neurotensin(NT)and morphological changes of gastric antrum were observed and compared.ResultsThe rat had mental fatigue,slow increase of body weight,sugar consumption decreased,activity reduction,gastric emptying rate increase lower gastric emptying rate and intestinal propulsion rate decreased,and there was no inflammatory cell infiltration and other pathological changes.ConclusionThe modeling method is simple,repeatable rate is high,and it is worthy of further promotion and application.

functional dyspepsia;animal model;liver stagnation and spleen deficiency;animal experiment research

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.08.055

1672-2779（2017）-08-0132-03

張文娟 本文校對：李永成

2016-12-23）

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研專項課題【No：13099】