黃錦爐，譚曉晨，彭書華，曾宇鯤，林德杰

（廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州511400）

109株草魚源維氏氣單胞菌的耐藥性分析

黃錦爐1，譚曉晨1，彭書華1，曾宇鯤1，林德杰1

（廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州511400）

本實驗采用瓊脂擴散法，比較分析了109株草魚源維氏氣單胞菌對25種抗生素的耐藥情況。結(jié)果表明，89%以上的維氏氣單胞菌分離株對青霉素和新生霉素產(chǎn)生高度耐藥，70%以上的菌株對麥迪霉素、吉他霉素和克拉霉素不敏感，而菌株對強力霉素、諾氟沙星和鏈霉素敏感性較好，超過80%以上的菌株對氟苯尼考、阿齊霉素、環(huán)丙沙星和甲砜霉素表現(xiàn)敏感或高度敏感。

維氏氣單胞菌；草魚；抗生素；耐藥性

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是一種兼性厭氧的人魚共患的條件性病原菌［1-2］，具有嗜溫和運動性等特性，普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等環(huán)境中，可引起人的腹瀉［5］、敗血癥和急性膽管炎［6］、慢性呼吸道［7］等疾病，也可引起多種魚類患病，危害魚類品種包括丁鱥（Tinca tinca）［3］和泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）［4］、中華鱉（Pelodiscus sinensis）［5］和斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、烏鱧（Ophicephalus argus）［7］，不僅危害人類的公共衛(wèi)生安全，也威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

維氏氣單胞菌對草魚的養(yǎng)殖危害日益顯現(xiàn)，以春秋兩季的原發(fā)性感染和并發(fā)感染的病癥最為常見，感染癥狀上多以草魚體表不規(guī)則斑狀出血、出血性腸炎等為主，感染死亡率為5-15%。目前，針對維氏氣單胞菌等細菌性疾病的防治仍以抗生素拌飼內(nèi)服為主，由于養(yǎng)殖生產(chǎn)終端技術(shù)條件限制，防治性藥物的選擇往往缺乏有效的用藥參考依據(jù)，導(dǎo)致不同區(qū)域相似感染案例之間的藥物防治效果存在較大差異。因此，本試驗以分離自不同年份和區(qū)域的草魚源維氏氣單胞菌109株為研究對象，采用瓊脂擴散法比較不同維氏氣單胞菌分離株的藥物敏感性差異，旨在為草魚源維氏氣單胞菌耐藥性研究與草魚養(yǎng)殖終端用藥參考提供有應(yīng)用價值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

維氏氣單胞菌：109株，分離自不同區(qū)域草魚，由廣東海大集團海大研究院保存提供，菌株來源見表1。

表1 109株維氏氣單胞菌的來源

續(xù)表

1.2 供試抗生素類藥物

供試抗生素類藥敏紙片共25種，購自杭州微生物試劑有限公司，其中β-內(nèi)酰胺類：青霉素（10 IU/片），氨芐西林（10 μg/片），頭孢拉定（30 μg/片），新生霉素（30 μg/片）；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素（15 μg/片），麥迪霉素（30 μg/片），吉他霉素（15 μg/片），克拉霉素（15 μg/片），阿奇霉素（15 μg/片）；氨基糖苷類：鏈霉素（10 μg/片），慶大霉素（10 μg/片），卡那霉素（30 μg/片），丁胺卡那霉素（30 μg/片），新霉素（30 μg/片），妥布霉素（10 μg/片）；四環(huán)素類：四環(huán)素（30μ g/片），強力霉素（30 μg/片），美滿霉素（30 μg/片）；氯霉素類：氟苯尼考（75 μg/片），甲砜霉素（30 μg/片）；喹諾酮類：諾氟沙星（10 μg/片），環(huán)丙沙星（5 μg/片）；其他：氯潔霉素（2 μg/片），磺胺嘧啶（300 μg/片），多粘菌素B（300 IU/片）。

1.3 細菌的培養(yǎng)

按無菌操作要求，挑取低溫保存的維氏氣單胞菌接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30℃條件下120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，收集菌液，4 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水進行稀釋，將稀釋菌液與McFarland比濁管進行細菌計數(shù)，使受試菌株的菌液終濃度均達到3×107cfu/ml。

1.4 藥敏試驗

試驗方法參考馬緒榮等［11］主編的《藥品微生物學(xué)檢驗手冊》推薦的紙片瓊脂擴散法。用無菌棉簽浸透生理鹽水稀釋的菌液，將過量菌液于管壁處加壓，旋轉(zhuǎn)擠出，取出棉簽并在M-H瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布，將M-H瓊脂培養(yǎng)基30℃恒溫箱中靜置數(shù)分鐘，使瓊脂培養(yǎng)基表面干燥，用無菌鑷子將不同的藥敏紙片均勻的貼在瓊脂培養(yǎng)基的表面，置30℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察、測量和記錄各菌株對供試藥敏紙片的抑菌圈直徑。試驗結(jié)果判定參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標準進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對β-內(nèi)酰胺類的耐藥性

由表2可知，β-內(nèi)酰胺類藥物對供試維氏氣單胞菌的抑制作用較弱，供試源維氏氣單胞菌對包括青霉素在內(nèi)的四種藥物具有較嚴重的耐藥性。其中供試維氏氣單胞菌對新生霉素耐藥率達100%，而對青霉素、氨芐西林和頭孢拉定這三種藥物的耐藥率分別為89.0%、81.6%、77.1%。檢測結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌對頭孢拉定的敏感率最高，達到13.8%，而對青霉素和氨芐西林的敏感率則分別僅為6.4%和9.2%。然而，綜合來看，β-內(nèi)酰胺類藥物對供試維氏氣單胞菌的體外抑菌效果并不理想。

表2 維氏氣單胞菌對β-內(nèi)酰胺類的耐藥性

2.2菌株對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性

由表3可知，大環(huán)內(nèi)酯類藥物對供試維氏氣單胞菌雖有一定抑制作用，但抑制效果并不理想，多數(shù)抑菌圈直徑都介于耐藥和敏感的之間，其中菌株對克拉霉素的耐藥程度最嚴重，其耐藥率達到77.1%，而對吉他霉素和麥迪霉素的耐藥率次之，分別為75.2%和71.8%。供試維氏氣單胞菌對紅霉素的耐藥率為26.4%，介于耐藥和敏感的菌株數(shù)量約達60%。供試維氏氣單胞菌對阿奇霉素的敏感性最好，對該藥的敏感率高達85.4%，而耐藥率僅為13.8%。

表3 維氏氣單胞菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性

2.3 菌株對氨基糖苷類的耐藥性

由表4可知，供試維氏氣單胞菌對氨基糖苷類藥物的均具有良好的敏感性，超過49%的菌株對6種藥物全部敏感，供試菌株對新霉素的敏感率最高，達到73.4%；而供試菌株對慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素和妥布霉素的敏感率依次降低，分別為71.6%、65.1%、54.5%、50.5%和49.5%。另一方面，供試菌株對妥布霉素和卡那霉素介于耐藥和敏感之間的比例較高，分別為37.7%和36.7%；然而供試菌株對藥物的耐藥性最高和最低的品種依次是丁胺卡那霉素（27.3%）、卡那霉素（12.8%）和妥布霉素（12.8%）。

表4 維氏氣單胞菌對氨基糖苷類的耐藥性

2.4 菌株對四環(huán)素類的耐藥性

受試菌株對四環(huán)素類藥的敏感程度大小不一。由表5可知，供試維氏氣單胞菌對強力霉素的敏感率達到75.2%，對四環(huán)素的敏感率次之，達59.6%，而對美滿霉素的敏感率僅有7.3%。另一方面，供試菌株對四環(huán)素的耐藥率最高，達31.2%；對美滿霉素的耐藥率僅為15.7%，而對美滿霉素介于耐藥和敏感之間的比例卻約達78%。

表5 維氏氣單胞菌對四環(huán)素類的耐藥性

2.5 菌株對其他抗生素類的耐藥性

從由表6可知，氟苯尼考、甲砜霉素對供試維氏氣單胞菌具有良好的敏感性，敏感率分別達到93.6%和80.7%?；前粪奏┰嚲暌簿哂辛己玫拿舾行?，其敏感率達63.6%。約69%的供試菌株對林可霉素類的氯潔霉素高度耐藥，其敏感率僅為9.1%；約18%的供試菌株對多粘菌素B高度耐藥，其敏感率高達41.3%，介于耐藥與敏感之間的約占41%。從菌株對人工合成類藥物的耐藥情況看，對環(huán)丙沙星敏感的供試菌株對諾氟沙星也表現(xiàn)敏感，其中對諾氟沙星表現(xiàn)敏感的菌株分別為81.6%和72.5%，然而也有超過13%的供試菌株對環(huán)丙沙星和諾氟沙星完全耐藥。

表6 維氏氣單胞菌對其它抗生素類的耐藥性

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛分布于淡水、淤泥和污水等環(huán)境中，通常在水體養(yǎng)殖環(huán)境惡化和魚體體質(zhì)較弱時，對多種養(yǎng)殖魚類具有不同程度的致病性，防控不及時或用藥不當(dāng)時可造成養(yǎng)殖魚類的大面積死亡［4，8，9］，因此，針對不同分離源維氏氣單胞菌開展菌株耐藥性分析對于有效防控該菌感染病例具有十分重要的指導(dǎo)意義。研究表明，不同動物源的維氏氣單胞菌存在生物特性差異，對抗生素的耐藥性也存在差異［10］，而相同菌株對不同抗生素的抗菌后效應(yīng)也存在差異［11］。本實驗對109株草魚源維氏氣單胞菌的耐藥性研究也獲得相似的結(jié)果，即不同年份不同地區(qū)的維氏氣單胞菌分離株對抗生素的耐藥性表現(xiàn)均存在一定程度的差異，然而可喜的是，包括供試維氏氣單胞菌對氟苯尼考、甲砜霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、強力霉素等抗生素在內(nèi)的多種仍具有極高的敏感性。

本試驗中，來自不同分離區(qū)域的草魚源維氏氣單胞菌已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象，其中菌株對β-內(nèi)酰胺類的新生霉素、氨芐西林和頭孢拉定的耐藥性最為嚴重，其耐藥率均在80%以上，雖然超過13.8%的菌株對頭孢拉定敏感，但是菌株對該藥的耐藥率也達到77%；而供試菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物中的麥迪霉素和克拉霉素的耐藥率也超過70%。這表明，用于本試驗的β-內(nèi)酰胺類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物對供試維氏氣單胞菌的體外抑菌效果并不理想。據(jù)報道，革蘭氏陰性菌對β-內(nèi)酰胺類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性與菌株染色體或質(zhì)粒上攜帶的耐藥基因有關(guān)［12］。在耐藥基因的介導(dǎo)下，菌株分泌的β-內(nèi)酰胺酶類與β-內(nèi)酰胺類的內(nèi)酰胺活性基團共價結(jié)合后使其發(fā)生水解，導(dǎo)致藥物失效［13-14］；而細菌通過產(chǎn)生鈍化酶使藥物大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)發(fā)生水解或通過產(chǎn)生甲基化酶使位于菌株核糖體50S亞單位的23S RNA的腺嘌呤甲基化，導(dǎo)致抗菌藥物不能與活性部位結(jié)合而失效［15］。因此，在本試驗基礎(chǔ)上，下一步工作針對109株供試維氏氣單胞菌的耐藥基因進行檢測與分析，將有利于在基因水平上的分析結(jié)果與本試驗結(jié)果進行比較聯(lián)系，也有利于闡明維氏氣單胞菌對這兩類藥在基因水平上的耐藥機制。

本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)兩種有趣的現(xiàn)象，一是不同地區(qū)分離的維氏氣單胞菌對同一種抗生素的耐藥程度是存在差異，如從洪湖、安鄉(xiāng)和漢壽等地區(qū)分離到的菌株對紅霉素、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素等的耐藥性均存在著差異；二是相同地區(qū)分離的維氏氣單胞菌對同一種抗生素的耐藥性也有差異，如在不同時間從洪湖地區(qū)分離到的菌株對甲砜霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、強力霉素、環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶的耐藥性表現(xiàn)也存在差異，但這種差異只屬于個別的現(xiàn)象。有學(xué)者認為，以上這兩種現(xiàn)象與養(yǎng)殖地區(qū)長期使用單一藥物、給藥途徑、用藥劑量以及耐藥菌株通過各種媒介傳播等因素密切相關(guān)［16-17］。從表4～6可知，多數(shù)供試菌株對氟苯尼考、甲砜霉素、環(huán)丙沙星和強力霉素等藥物具有良好的敏感性，敏感率都在75%以上，這表明，以上這幾種抗生素對維氏氣單胞菌的體外抑菌效果很好，而菌株對這幾種藥物的耐藥現(xiàn)象也不普遍。供試維氏氣單胞菌對紅霉素和多粘菌素等藥物介于耐藥和敏感之間的比例分別為59.6%和40.5%，而對包括妥布霉素和卡那霉素在內(nèi)的多種抗生素介于耐藥和敏感之間的比例已超過35%，這種現(xiàn)象應(yīng)該引起重視，如果生產(chǎn)上在藥物的給藥途徑、用藥劑量、藥物配伍等方面能夠得到有效規(guī)范，及時清理感染死亡魚避免病原擴散，是可以減緩這部分介于耐藥和敏感的菌株趨向耐藥性或完全耐藥性的過程的。

從本研究團隊近年來對我國草魚主要養(yǎng)殖區(qū)的病原菌流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果來看，維氏氣單胞菌在草魚發(fā)病病例中陽性檢出率越來越高，既有單發(fā)性感染，也有并發(fā)感染，所引起草魚發(fā)病癥狀表現(xiàn)包括赤皮、腸炎、爛尾和爛鰓等，導(dǎo)致生產(chǎn)終端難以根據(jù)有效的鑒別方法對維氏氣單胞菌感染病例做出比較可靠的診斷，有時往往也因此延誤了病情。因此，我們建議在選擇維氏氣單胞菌感染癥的治療藥物時，條件允許的情況下應(yīng)先進行規(guī)范的藥敏試驗篩選敏感藥物，同時結(jié)合藥物的種類和特性，確定藥物的有效給藥途徑和使用劑量，如將藥物拌飼投喂時，可考慮同時配合使用適量的粘合劑［18］，以減少藥物在水中溶散而導(dǎo)致感染魚采食時攝入的藥物劑量未能達到有效抑制或殺滅病原菌的作用，尤其是對于選用水溶性抗生素類藥物進行治療時更應(yīng)該注意了。在防治維氏氣單胞菌病并發(fā)感染其他細菌時，可采用聯(lián)合用藥的方式進行，但應(yīng)注意抗生素的配伍禁忌以及交替用藥［19］，以確保選用的藥物能發(fā)揮更好的療效。

［1］楊正時.氣單胞菌屬分類學(xué)研究進展［J］.中國人獸共患病雜志,1990,6（1）:49-52.

［2］房海,陳翠珍,張曉君,等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗［J］.中國人獸共患病學(xué)報,2008,24（1）:45-49.

［3］林啟存,蔡麗娟,楊仲景.丁鱥潰瘍病的病原菌分離、鑒定與人工感染試驗［J］.水產(chǎn)科學(xué),2005,24（11）:21-22.

［4］汪開毓,陸艷,耿毅,等.維里納氣單胞菌致泥鰍潰瘍病的病理學(xué)觀察［J］.水利漁業(yè),2008,28（4）:117-120.

［5］李本旺,李春枝,張邦杰,等.中華鱉口咽腔潰爛綜合癥病原的研究［J］.水產(chǎn)科技情報,2000,27（5）:210-213.

［6］黃小麗,汪開毓.斑點叉尾鮰維氏氣單胞菌病的診斷與防治［J］.水產(chǎn)科技情報,2009,36（5）:240-241.

［7］張海月,康元環(huán),孫武文,等.烏鱧源維氏氣單胞菌胞外產(chǎn)物的生物學(xué)活性分析［J］.中國獸藥雜志,2016,50（10）:6-9.

［8］RAHMAN M,COLQUE-NAVARRO P,KUHN I,et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Appl Environ Microbiol,2002,68（2）: 650-655.

［9］黃文明,王利,冀國楨，等.胭脂魚維氏氣單胞菌和中間氣單胞菌的鑒定及藥物敏感性［J］.水產(chǎn)科學(xué),2013,32（4）: 210-214.

［10］單曉楓,康元環(huán),夏京津,等.不同動物源性維氏氣單胞菌生物學(xué)特性比較研究［J］.中國獸醫(yī)雜志,2015,51（3）: 82-85.

［11］張路,徐洋,潘曉藝，等.5種喹諾酮類藥物對維氏氣單胞茵體外抗生素后效應(yīng)的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2015, 37（2）:106-109.

［12］李遠志,白曉梅,賀智英.細菌的耐藥機制［J］.延安大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）,2007,5（1）:6-7.

［13］LIVERMORE D M.Beta-lactamase-mediated resistance and opportunities for its control［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1998,41（4）:25-41.

［14］MOOSDEENF.The evolution ofresistance tocephalosporins［J］.Clinical Infectious Diseases,1997,24（3）:487-493.

［15］王睿,柴棟.細菌耐藥機制與臨床治療對策［J］.抗生素分冊,2003,24（3）:97-103.

［16］林璐明,蘇躍朋.水產(chǎn)抗生素類藥物的耐藥性機制及合理應(yīng)用［J］.河北漁業(yè),2009（5）:42-43.

［17］張日亮,牛立國,王淑華.談水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體形成耐藥性的原因、后果及對策［J］.黑龍江水產(chǎn),2007（4）:47-48.

［18］聶國興,王俊麗.魚用非營養(yǎng)性添加劑的研究與應(yīng)用［J］.科學(xué)養(yǎng)魚,2000（7）:40-41.

［19］童軍.水產(chǎn)養(yǎng)殖中病原生物的耐藥性及其防止對策［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖,1992（2）:22-24.

【責(zé)任編輯：鄧軍文 dengjunwen69@126.com】

The resistance to antibiotics of 109 Aeromonas veronii isolated from Ctenopharyngodon idellus

HUANGJin-lu1,TANXiao-chen1,PENGShu-hua1,ZENGYu-kun1,LINDe-jie1
（Animal Husbandryand Fisheries Research Center ofGuangdongHaid Group Co.,Limited,Guangzhou 511400,China）

Basing on the agar diffusion method,the resistance of 109 Aeromonas veronii isolated from Ctenopharyngodon idellus to twenty five antibiotics was analyzed.As the result showed,over 89 percent A. veronii isolations were resistant to Penicillin and Novobiocin.Also over 70 percent A.veronii isolations were insensitive to Midecamycin,Kitasamycin and Clarithromycin.However,many A.veronii isolations were well sensitive to Tetracycline,Norfloxacin and Streptomycin.Over 80 percent of A.veronii isolations were sensitive and hypersensitive toFlorfenicol,Azithromycin,and Norfloxacin Ciprofloxacin Thiamphenicol.

Aeromonas veronii;Ctenopharyngodon idellus;antibiotic;resistance

S943

A

1008-0171（2017）02-0066-06

2017-02-21

黃錦爐（1982-），男，廣東揭陽人，廣東海大集團股份有限公司博士。