王志波， 李成思， 張金魁， 林鵬程

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院， 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810007)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化西芹葉中總黃酮的提取工藝

王志波1,2,3， 李成思1,2,3， 張金魁1,2,3， 林鵬程1,2,3

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院， 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810007)

以青海西芹葉為研究對象，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化西芹葉中總黃酮的提取工藝，并以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比為考察要素，進(jìn)行三因素五水平星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)通過方差分析回歸建立數(shù)學(xué)模型，響應(yīng)面分析法優(yōu)化西芹葉中總黃酮的提取工藝。結(jié)果顯示，料液比和提取時(shí)間對西芹葉的總黃酮提取影響極其顯著，最優(yōu)提取工藝為提取時(shí)間50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20 (g/mL)。在此條件下，相對誤差為1.24%，與模型預(yù)測值相符，總黃酮得率為18.36 mg/g。該工藝合理、快速，為今后西芹葉中總黃酮研究奠定基礎(chǔ)。

西芹葉；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法；總黃酮

引言

西芹(ApiumgraveolensL.)為傘形花科旱芹屬植物，原產(chǎn)自地中海沿岸，是一種藥食同源蔬菜。西芹營養(yǎng)豐富，其中黃酮類化合物含量很高，具有多種藥理作用和生物活性，對一些常見疾病有很好的治療和預(yù)防作用，如抗癌防癌、降低血脂、治療高血壓，及保護(hù)心血管和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[1]。

本文采用的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法，是一種可以將數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合起來的新型實(shí)驗(yàn)方法，其優(yōu)點(diǎn)是克服正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的精密度不足，操作繁瑣的缺陷。同時(shí)又能較好的對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測[2]。并且，查閱文獻(xiàn)得知，近年關(guān)于西芹葉中總黃酮的研究還未見報(bào)道，因此本文通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法對西芹葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可為藥用西芹葉的質(zhì)量評價(jià)及進(jìn)一步的研究開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

西芹葉采于青海省互助縣(經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院鑒定為傘形科植物西芹)；蘆丁購于中國藥品生物制品鑒定所；蒸餾水自制；其余所用試劑均為分析純。

1.2儀器

UV-5100B分光光度計(jì)(上海重逢科技有限公司)；FA1064N型電子天平(上海精密儀器)；DFY-200C粉碎機(jī)(上海谷寧實(shí)業(yè)有限公司)；KQ-300B型超聲波提取器(昆山市超聲儀器)。

1.3方法

1.3.1待測溶液的制備

取干燥的西芹葉樣品粉末1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 60%乙醇超聲提取30 min，待提取液冷卻后，過濾取其濾液，既得待測溶液。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將精密稱取的3.25 mg蘆丁用70%乙醇定容于25 mL容量瓶中。然后，分別精密吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL蘆丁溶液，于25 mL容量瓶中。依據(jù)顯色條件依次加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、NaOH溶液，并在510 nm波長處依次測定吸光度[3]，得到回歸方程為：y=27.288，x-0.0269，R2=0.9998，表明線性關(guān)系較好。

1.3.3總黃酮含量測定

準(zhǔn)確移取1.0mL待測溶液，按照1.3.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終得出西芹葉總黃酮量的計(jì)算公式為[4]：

其中，Y：黃酮提取量(mg/g)；A：吸光度；m：樣品質(zhì)量(g)。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

在選定的條件下，即分別固定50%乙醇、提取時(shí)間50 min、料液比1∶20 (g/mL)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比分別進(jìn)行考察[5]，結(jié)果如圖1所示。

圖1各因素對總黃酮提取率的影響折線圖

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果初步選定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間50 min、料液比1:20 (g/mL)為最佳提取條件[6]，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法對其進(jìn)行優(yōu)化[7]。

2.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

依據(jù)星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法原理，以提取率為參考指標(biāo)[8]。用X1，X2，X3表示所設(shè)因素，各個(gè)因素設(shè)五水平，并以1.73、1、0、-1、-1.73表示自變量的水平，表1為各要素水平編碼表，表2為星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果[9]。

表1因素水平

表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2模型擬合

以總黃酮提取率為參考指標(biāo)[10]，用Design Expert軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)擬合回歸，得模型方程[11]：

Y=18.56+0.46X1-0.46X2+0.97X3+0.025X1X2+

該模型方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，模型的P值小于0.0001，說明模型方差極顯著；各自變量P值<0.05，說明本實(shí)驗(yàn)所考察的各單因素對西芹葉總黃酮提取率影響顯著[12]；綜合分析二次項(xiàng)中X1、X2、X3的響應(yīng)值，得出試驗(yàn)所考察的三個(gè)因素對總黃酮提取率的影響是一種二次曲線關(guān)系，并非簡單的線性關(guān)系[13]；方程的失擬項(xiàng)P值0.0733>0.05不顯著，表明其他未知因素的影響可以忽略不計(jì)[14]。

表3響應(yīng)面分析試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：**:差異極顯著，p<0.0001；*:差異顯著，p<0.05。

2.2.3響應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert軟件，得出交互作用影響極顯著的3D響應(yīng)面圖，如圖2、圖3所示。

圖2乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比影響總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖3乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間影響總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

通過圖2、圖3的曲面走勢可知，各自變量對總黃酮的影響都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢[15]。同時(shí)依據(jù)曲面的陡峭程度得出，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比的交互作用對西芹葉總黃酮提取率的影響極其顯著[16]。故全面分析該回歸模型，最終確定最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)49.65%，料液比1:19.86(g/mL)，提取時(shí)間48.4 min，總黃酮提取率18.59(mg/g)。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度，以得出的最優(yōu)工藝為前提條件做6次平行試驗(yàn)?？傸S酮平均收率為18.36(mg/g)，相對誤差1.24%，與預(yù)測值基本一致。

3結(jié)束語

文獻(xiàn)檢索表明，西芹葉總黃酮的提取工藝未見使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法，因此難找到一種確切的函數(shù)式來表達(dá)各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，也就無法找到考察各因素在整個(gè)區(qū)域上的最佳組合，并對響應(yīng)值的最優(yōu)值進(jìn)行預(yù)測。

本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法，用二次多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示，該方法不僅提高了試驗(yàn)的精確度，還得到了最佳的模型擬合度。同時(shí)證實(shí)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法得到的最佳工藝參數(shù)可靠準(zhǔn)確，最終優(yōu)化得到西芹葉總黃酮的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶20(g/mL)，提取時(shí)間50 min，總黃酮得率為18.36(mg/g)，為今后西芹葉中總黃酮研究奠定了科學(xué)有效的基礎(chǔ)。

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Application of CCD-RSM for Optimization of Total Flavonoids Extraction in Celery Leaves

WANGZhibo1,2,3,LIChengsi1,2,3,ZHANGJinkui1,2,3,LINPengcheng1,2,3

(1.College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China; 2.Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research, Xining 810007, China; 3.Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai, Xining 810007, China)

The extraction process of total flavonoids from celery leaves is optimized by CCD-RSM. The effects of ethanol concentration, extraction time, material liquid ratio are taken as the factors of investigation to lead three-factor five-level star-point test design. Simultaneously, the mathematical model is established by regression analysis of variance, and the extraction process of total flavonoids from celery leaves is optimized by the Response Surface Methodology. The results show that material liquid ratio and extraction time have significant effects on the extraction of flavonoids from celery leaves. And the optimum conditions are extraction time of 50 min, 50% ethanol concentration and material liquid ratio of 1∶20 (g/mL). The relative error of validation test is 1.24%, which is coincident with the predicted value. And the total yield of flavonoids was 18.36mg/g. The method is reasonable and rapid, which lays a foundation for the study of total flavonoids in celery leaves.

celery leaves; CCD; RSM; total flavonoids

2017-01-14

青海民族大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目(DCXM-2014-013)

王志波(1991-)，男，山東菏澤人，碩士生，主要從事藥物化學(xué)方面的研究，(E-mail)18297004813@163.com; 林鵬程(1966-)，男，青海西寧人,教授，博士，博導(dǎo)，主要從事天然藥用植物資源開發(fā)與利用方面的研究，(E-mail)qhlpc@126.com

1673-1549(2017)02-0007-04

10.11863/j.suse.2017.02.02

TB115

A