薛文峰 劉長利,2 陳 炎

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室,北京,100069)

北京地區(qū)種植不同種源的柴胡藥材質(zhì)量分析

薛文峰1劉長利1,2陳 炎1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京,100069; 2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室,北京,100069)

目的:通過田間種植試驗,分析不同種源的柴胡藥材質(zhì)量,為確定適宜北京地區(qū)種植柴胡的種源提供技術(shù)依據(jù)。方法:在北京市順義區(qū)設(shè)置田間試驗,種植從河北安國藥材市場、安徽亳州藥材市場、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所購買的3個種源的柴胡,采用紫外-可見分光光度法及高效液相色譜(HPLC)法,測定藥材樣品中的柴胡總皂苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的含量,以甘肅、山西種植柴胡藥材為對照,評價北京地區(qū)3個不同種源的柴胡藥材質(zhì)量。結(jié)果:3種不同種源的柴胡藥材,在柴胡總皂苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d含量等化學(xué)成分指標與甘肅、山西種植柴胡藥材的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,且符合中華人民共和國藥典的標準,其中河北安國藥材市場、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所種源的藥材質(zhì)量更優(yōu)。結(jié)論:北京地區(qū)是種植柴胡的適宜產(chǎn)區(qū),種源可從河北安國藥材市場或中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所購買。

柴胡;種植;藥材質(zhì)量;北京地區(qū)

柴胡性辛、苦、微寒,入肝、膽、肺經(jīng),具有疏散退熱,疏肝解郁,舉陽氣的功效,用于感冒發(fā)寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂脫等證[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,在我國已有兩千多年的使用歷史。2015版《中華人民共和國藥典》收錄其來源為傘形科植物柴胡BupleurumchineseDC.或狹葉柴胡Bupleurumscorzonerifoliumwilld.的干燥根。

柴胡藥材以野生品種應(yīng)用為主,隨著對柴胡藥材的使用量的增加,野生柴胡不足以提供市場的需求。我國北方一些省區(qū)已開始進行柴胡的人工種植,而且柴胡的栽培技術(shù)發(fā)展迅速。但是由于柴胡的種植品種混亂[2],以及不同的種植品種、環(huán)境、地域、年限以及種植方法使得不同地區(qū)的柴胡質(zhì)量參差不齊[3]。歷史上北京沿燕山山脈一帶山區(qū)是北柴胡的主要產(chǎn)區(qū)之一。早在1992年在北京密云懷柔就有種植三島柴胡的文獻[4],后來李勇等[5]在延慶種植北柴胡,并且對種植北柴胡根腐病的病原菌鑒定,楊成民等[6]研究了平谷區(qū)種植北柴胡皂苷含量動態(tài)變化,建議柴胡在10月底果實成熟期適于采收。順義區(qū)位于北京市東北部,地處燕山南麓,年平均氣溫為11.5 ℃,年均相對濕度50%,年均降雨量約625 mm。安徽亳州藥材市場、河北安國藥材市場等主要中藥藥材市場,市場主流商品種植北柴胡產(chǎn)地以甘肅和山西產(chǎn)地為主。

在北京市順義區(qū)設(shè)置田間試驗,種植從河北安國藥材市場、安徽亳州藥材市場、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所購買的3個種源的柴胡,采用紫外-可見分光光度法及高效液相色譜(HPLC)法,測定藥材樣品中的柴胡總皂苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的含量,以甘肅、山西種植柴胡藥材為對照,評價北京地區(qū)3個不同種源的柴胡藥材質(zhì)量,為確定京郊山區(qū)人工種植北柴胡的種源類型提供技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity);紫外分光光度計(UV-6100S);電子天平(SOP);超聲清洗儀(KQ5200DV)。

1.2 試藥 柴胡皂苷d對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號110778-201409);柴胡皂苷a對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號110777-201409);柴胡皂苷c對照品購自中國科學(xué)院成都生物研究所(批號20736-08-7);乙腈(AS1122-001)TEDIA,對二甲氨基苯甲醛(L1410064)購自阿拉丁公司,甲醇、磷酸購自北京化工廠,娃哈哈純凈水。

1.3 分析樣品 試驗田位于北京順義區(qū)河南村,2015年4月播種,人工撒播,播深1 cm,行距25 cm,畝播量1.5 kg[7],出苗后不間苗。生長期間干旱時噴灌澆水,人工除草,不施肥,種子來源為3種,分別來源于河北安國藥材市場、安徽亳州藥材市場、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。于2016年5月,選擇出苗均勻,生長正常地塊,按S行取樣,取同一種源柴胡為3份,試驗田柴胡共為9份。收集甘肅4個地區(qū)、山西3個地區(qū)種植2年生北柴胡,每個地區(qū)柴胡平行3份,共21份。所有柴胡藥材及種子,經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)劉長利副教授鑒定為北柴胡BupleurumchineseDC.。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以甲醇配制一定濃度的柴胡皂苷a溶液,精密吸取0.80 mL,100 ℃水浴揮干,加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL,繼續(xù)100 ℃水浴揮干,加入磷酸4.0 mL,70 ℃反應(yīng)30 min,按照紫外-可見分光光度法(參照《中華人民共和國藥典》)于200～800 nm范圍內(nèi)進行波長掃描,發(fā)現(xiàn)全波長掃描結(jié)果在528 nm處,有最大吸收峰,故確定檢測波長為528 nm。分析柱為Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(B)-水(A);流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,柱溫25 ℃,紫外檢測波長為210 nm,采用梯度洗脫方式測定,(0～5 min,35%B→40%B;5～15 min,40%B→45%B;15～25 min,45%B→55%B;25～30 min,55%B→90%B;30～45 min,90%B→35%B)。

表1 柴胡樣本收集表

注:1號樣本種源來自河北安國藥材市場;2號樣本種源來自安徽亳州藥材市場;3號樣本種源來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

2.2 對照品溶液的制備 將精密稱取柴胡皂苷a標準品適量,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液(精稱量1.74 mg標準品,溶于2 mL甲醇中,超聲溶解),搖勻,即得濃度為0.868 8 mg/mL的標準品液。稱取柴胡皂苷a、c、d標準品4.37 mg、3.35 mg、4.55 mg,溶于2 mL甲醇中逐級稀釋,用作柴胡皂苷a、c、d的測定。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定柴胡樣品粉末(過四號篩)0.20 g,加入5%濃氨水試液的甲醇溶液25 mL,30 ℃水溫超聲處理30 min,過濾,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘渣加少量水溶解,再用水飽和正丁醇萃取,回收正丁醇至干,甲醇溶解,并定容至5 mL,搖勻,0.45 μm微孔濾膜濾過,作為測定總皂苷的供試品溶液。

取柴胡粉末(過四號篩)精密稱定0.50 g,加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL,密閉,30 ℃水溫超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30 min,過濾,洗液與濾液合并,回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,0.45 μm微孔濾膜濾過,即得作為測定柴胡皂苷a、c、d的供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 將柴胡皂苷a標準品液逐級稀釋,即得不同濃度(0.00543、0.01086、0.02172、0.04344、0.08688、0.15204 mg/mL)的對照品稀釋液,以空白溶媒作為空白校正,在528 nm處測定各稀釋液吸光度,用于柴胡總皂苷的測定?；貧w曲線方程Y=6.786X+0.017,r=0.9997,線性范圍0.00543～0.15204。

稱取柴胡皂苷a、c、d標準品4.37 mg、3.35 mg、4.55 mg,溶于2 mL甲醇中逐級稀釋,按方法進樣20 μL測定,以峰面積為縱坐標(Y),濃度(mg/mL)為橫坐標(X),對各對照品進行回歸分析,用于SSa、SSc、SSd的測定。見表2。

表2 柴胡中有效成分線性回歸方程

2.5 精密度試驗 吸取柴胡皂苷a稀釋液0.80 mL,按“2.1”方法測定吸光度,重復(fù)上述步驟測定6次,柴胡皂苷a標準品的RSD值為1.881%,證明此儀器精密度良好。柴胡SSa、SSc、SSd標準品為供試液,連續(xù)進樣6次,柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的RSD分別為0.2864%、0.9026%、0.1337%,證明該儀器的精密度良好。

2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取柴胡粉末0.20 g,精密稱定。按“2.3”中供試液的制備方法操作,吸取供試液0.80 mL,按“2.4”方法分別于0、5、10、15、20、25、30、45、60 min測定吸光度,樣品總皂苷吸光度值的SRD為0.492%,證明總皂苷含量在0～60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。取1號柴胡,按照提取方法平行制備6份供試品溶液,照色譜條件,分別在0,2,4,6,8,24 h進樣分析,記錄峰面積,計算其相對標準偏差,SSa、SSc、SSd的RSD分別為4.219%、1.319%、3.509%,證明SSa、SSc、SSd的穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取柴胡粉末0.20 g,精密稱定,共6份。按“2.3”供試液的制備方法操作,吸取供試液0.80 mL,按“2.4”方法測定總皂苷吸光度,樣品總皂苷含量的RSD值為2.822%,證明此方法重現(xiàn)性良好。同1號柴胡6份,測定SSa、SSc、SSd含量,SSa、SSc、SSd的RSD分別為3.576%、2.503%、2.982%,證明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 回收率試驗 取柴胡粉末0.20 g,精密稱定6份。加入柴胡皂苷a標準品適量。按“2.3”供試液的制備方法操作,吸取供試液0.80 mL,按“2.4”方法測定,結(jié)果表明：總皂苷的平均加樣回收率為98.870%,RSD值為1.699%,符合實驗要求。取1號柴胡6份,分別加入一定含量的對照品,按照“2.3”方法制備供試液,進樣20 μL,記錄目標峰峰面積,計算回收率,SSa、SSc、SSd的平均加樣回收率分別為100.26%、101.64%、100.62%,RSD值分別為4.5884%、2.1983%、3.4808%,符合實驗要求。

2.9 樣品測定結(jié)果

2.9.1 各成分的測定結(jié)果 按供試品溶液制備方法制備,測定各成分含量。根據(jù)回歸曲線方程計算柴胡總皂苷及SSa、SSc、SSd的含量見表3。

2.9.2 各成分比較分析 北京種植3種源北柴胡與甘肅、山西總皂苷含量各不相同。見圖1,其中以甘肅武山縣北柴胡總皂苷的含量為最高,山西運城縣種植北柴胡總皂苷含量則最低,北京種植3種源種植柴胡皂苷含量差異較小;在SSa+SSd含量方面,除山西運城縣種植柴胡未達到藥典標準,其他所測北柴胡SSa+SSd含量均能達到2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的不小于0.30%的要求,其中以甘肅武山縣種植柴胡SSa+SSd含量最高,山西運城縣最低。見表3;所測柴胡中SSa、SSc、SSd含量各不相同,以甘肅武山縣種植北柴胡SSa、SSd含量最高,山西運城縣最低;甘肅漳縣三岔鎮(zhèn)SSc含量最高,北京種植安徽亳州藥材市場種源最低。見圖2。

表3 不同產(chǎn)地柴胡總皂苷含量結(jié)果±s)

圖1 不同柴胡樣本總皂苷含量差異

圖2 不同柴胡樣本SSa、SSc、SSd含量差異

為了進一步比較北京種植北柴胡與主流商品產(chǎn)地甘肅、山西種植柴胡的質(zhì)量,以甘肅、山西種植為一個樣本,分別與北京種植不同種源柴胡實驗數(shù)據(jù)進行分析,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？梢钥闯霰本┓N植不同種源柴胡與山西、甘肅種植北柴胡差異無統(tǒng)計學(xué)意義,在化學(xué)成分上來說,北京種植柴胡與主流產(chǎn)地商品差異無統(tǒng)計學(xué)意義,北京種植3個種源的北柴胡可以作為藥材使用。

2.9.3 聚類結(jié)果分析 將10份樣本進行系統(tǒng)聚類,結(jié)果見圖3,結(jié)果表明10份樣本分為2類:第Ⅰ類為樣本1,9,2,4,7,3,10,8;第Ⅱ類為樣本5,6。表明北京種植北柴胡能夠與全部山西種植北柴胡、大部分甘肅種植北柴胡完全聚為一支,說明北京種植3種源北柴胡與甘肅、山西差異不大。

圖3 10份樣本聚類分析樹狀圖

3 討論

現(xiàn)在我國野生中藥資源日趨減少,全國各地正大力發(fā)展中藥栽培產(chǎn)業(yè)[8],中藥柴胡現(xiàn)已在甘肅、山西、四川、河北等[9]地形成了規(guī)?；N植。但是由于野生柴胡來源混雜,存在引種非國家藥典種柴胡的現(xiàn)象,導(dǎo)致栽培柴胡的種質(zhì)也出現(xiàn)了混亂問題,栽培柴胡還存在品質(zhì)、產(chǎn)量待提高等問題[10]所以提高柴胡種植技術(shù)非常重要,而其中種質(zhì)篩選又是非常重要的一個環(huán)節(jié),本實驗就為確定適宜京郊山區(qū)人工種植柴胡的種質(zhì)類型提供技術(shù)依據(jù)。

本實驗結(jié)果初步說明北京地區(qū)栽培柴胡可達到現(xiàn)今市場主流商品柴胡(山西、甘肅)的質(zhì)量標準,且SSa+SSd含量符合《中華人民共和國藥典》要求,初步認為北京種植柴胡可作為商品流通。而在種質(zhì)篩選方面,發(fā)現(xiàn)安國、藥植所種源所含柴胡皂苷a、c、d含量相對于亳州種源含量更高,更值得進一步研究。聚類結(jié)果表明北京種植北柴胡能夠與全部山西種植北柴胡、大部分甘肅種植北柴胡完全聚為一支,說明北京各種植種源與主流商品柴胡具有較近的關(guān)系,在實驗所測的各指標上差異不大,推測是由于同為北柴胡所致。

對于發(fā)展北京地區(qū)種植柴胡,應(yīng)當進一步擴大試驗田種植面積以及種植區(qū)域,還需要對北京地區(qū)種植柴胡的病蟲害及產(chǎn)量等問題進一步研究。同時為了中藥柴胡資源的可持續(xù)發(fā)展,應(yīng)當加強野生中藥柴胡資源保護。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:105,158-159.

[2]潘勝利.中藥柴胡的藥源調(diào)查及商品鑒定[J].中藥材,1996,19(5):231-234.

[3]袁伯川,李文東,馬永生,等.柴胡屬藥用植物的分子鑒定及市售柴胡藥材的質(zhì)量調(diào)查[J].藥學(xué)學(xué)報,2017,52(1):162-171.

[4]索建政,宋清華.三島柴胡在北京地區(qū)的生長動態(tài)觀察[J].中藥材,1992,15(7):10-13.

[5]李勇,劉時輪,楊成民,等.北京地區(qū)柴胡根腐病的病原菌鑒定[J].植物病理學(xué)報,2009,39(3):314-317.

[6]楊成民,魏建和,程惠珍,等.北柴胡皂苷含量動態(tài)變化[J].中藥材,2006,29(4):316-318.

[7]李競,高英,李海龍,等.太行山區(qū)柴胡中總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量測定[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(8):124-126,129.

[8]段瓊輝,李永.中藥資源現(xiàn)狀與可持續(xù)發(fā)展[J].西部中醫(yī)藥,2013,26(10):142-144.

[9]秦雪梅,王玉慶,岳建英.栽培柴胡資源狀況分析[J].中藥研究與信息,2005,7(8):30-32.

[10]孟祥才,馬礴,楊興旺,等.柴胡基源及栽培柴胡種質(zhì)問題的探討[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2011,25(2):29-31.

(2016-08-26收稿 責任編輯：王明)

Medicinal Materials Quality Analysis of Different Provenances of Radix Bupleuri Planted in Beijing

Xue Wenfeng1，Liu Changli1，2，Chen Yan1

(1SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicineUniversity，Beijing100069，China；2BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTeoryReaserch，Beijing100069,China)

Objective:To analysis of different provenances of radix bupleuri medicinal materials quality using field planting test, and to determine the provenance of suitable cultivation of radix bupleuri in Beijing. Methods:Field experiment was set in Shunyi district of Beijing, growing 3 provenances of radix bupleuri bought from Hebei Anguo medicine market, Anhui Bozhou medicine market and Chinese academy of medical sciences institute of medicinal plant. By ultraviolet-visible spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) method, total saponins in radix bupleuri, radix bupleuri saponins (a,b and c) were measured. Compared with those cultivated in Gansu and Shanxi, those three different provenance of radix bupleuri medicinal materials′ quality were evaluated. Results:Three different provenance of radix bupleuri had few difference comparing with those cultivated in Gansu and Shanxi in total saponins in radix bupleuri,and radix bupleuri saponins (a,b and c), besides, it met with Chinese pharmacopoeia standards, in which product of Hebei Anguo medicine market and Chinese academy of medical sciences institute of medicinal plant shared better quality.Conclusion:Beijing is suitable for planting of radix bupleuri, and provenance from hebei anguo medicine market or the Chinese academy of medical sciences institute of medicinal plant can be purchased.

Radix bupleuri; Planting; Medicinal materials′ quality; Beijing

北京市自然科學(xué)基金面上項目(編號:6142002)

薛文峰(1988.12—),男,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院在讀碩士研究生,研究方向:中藥資源,E-mail:xuewenfeng.boy@163.com

劉長利(1974.11—),男,博士,副教授,研究方向:中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及其藥材質(zhì)量調(diào)控研究,E-mail:lcl74@126.com

R282.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.043