曠湘楠 王少賢 方朝義 王杰鵬 陳家旭 劉玥蕓

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊，050200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

逍遙散調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核ob-R、α-MSH變化機(jī)制

曠湘楠1王少賢1方朝義1王杰鵬1陳家旭2劉玥蕓2

(1 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊，050200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：研究中藥復(fù)方逍遙散(《太平惠民和劑局方》)疏肝解郁、健脾以調(diào)節(jié)食欲的作用機(jī)制。方法：以每天持續(xù)3 h慢性束縛應(yīng)激方法制備動(dòng)物模型。SD健康雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、7 d模型組、21 d模型組和逍遙散組4組，正常組予常規(guī)飼養(yǎng)，模型組和逍遙散組每天選擇隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行束縛應(yīng)激，7 d模型組束縛應(yīng)激7 d，21 d模型組束縛應(yīng)激21 d，逍遙散組在連續(xù)束縛應(yīng)激21 d同時(shí)予逍遙散灌胃。觀測(cè)各組大鼠體重、攝食量、行為學(xué)、血清D-木糖含量變化；免疫熒光雙染、RT-qPCR方法觀測(cè)下丘腦ARC中瘦素受體(Leptin Receptor，ob-R)、α-促黑素細(xì)胞激素(α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH)基因與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，束縛應(yīng)激21 d模型大鼠體重、攝食量和血清D-木糖含量明顯降低，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明模型大鼠自主活動(dòng)能力下降、對(duì)新異環(huán)境探究行為明顯減少，而逍遙散則具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。綜合表明，每天3 h連續(xù)21 d捆綁束縛可制備慢性應(yīng)激肝郁脾虛樣動(dòng)物模型，慢性束縛應(yīng)激大鼠下丘腦弓狀核(Arcuate Nucleus，ARC)中ob-R、α-MSH表達(dá)水平增加，逍遙散可下調(diào)其表達(dá)。結(jié)論：逍遙散調(diào)節(jié)下丘腦ARC中ob-R和α-MSH表達(dá)變化，可作為其疏肝健脾，調(diào)節(jié)機(jī)體食欲和能量代謝影響脾胃功能的作用靶點(diǎn)之一。

慢性應(yīng)激；逍遙散；肝郁脾虛；瘦素受體；α-促黑素細(xì)胞激素

慢性、持久的應(yīng)激可誘發(fā)軀體或心理疾病。由工作問題、家庭問題、經(jīng)濟(jì)問題、人際關(guān)系問題等各種生活事件引發(fā)的心理應(yīng)激(心理壓力)，常常引發(fā)情緒障礙和以腹脹、食欲減退、大便失調(diào)為主要表現(xiàn)的脾胃功能失調(diào)，嚴(yán)重影響著我們的生活質(zhì)量。中醫(yī)中藥在調(diào)治慢性應(yīng)激方面療效顯著，逍遙散是中醫(yī)經(jīng)典心身同治復(fù)方，為國內(nèi)學(xué)者抗應(yīng)激的首選方劑。

本課題組一直從事中藥復(fù)方逍遙散(《太平惠民和劑局方》)防治慢性心理應(yīng)激研究工作[1-5]，尤其對(duì)其調(diào)理脾胃運(yùn)化，調(diào)節(jié)食欲的效應(yīng)進(jìn)行了重點(diǎn)研究。本研究以束縛捆綁方式制備慢性應(yīng)激動(dòng)物模型，結(jié)合動(dòng)物攝食量、體重、行為學(xué)變化，運(yùn)用免疫熒光雙染、實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)與方法，從基因與蛋白水平，檢測(cè)下丘腦(Arcuate Nucleus，ARC)中瘦素受體(Leptin Receptor，ob-R)、α-促黑素細(xì)胞激素(α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH)表達(dá)，探討逍遙散疏肝解郁、助脾胃運(yùn)化功能與調(diào)食欲的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 SD健康雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)：室溫(21±1)℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照明暗各12 h(明7：00—19：00，暗19：00—7：00)，自由飲用純凈水，予常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周，按體重編號(hào)，查隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)分為4組：正常組、7 d模型組、21 d模型組、逍遙散組各24只，每4只大鼠飼養(yǎng)于1籠，每組6籠。

1.1.2 藥物 逍遙散制備：逍遙散，出自《太平惠民和劑局方》，按照原書組方，由當(dāng)歸、白芍、柴胡、白術(shù)、茯苓、甘草、煨生姜、薄荷8種中藥按3∶3∶3∶3∶3∶1.5∶1∶1比例，由河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理室進(jìn)行鑒定和提取，最終制成干粉備用。所有生藥均購自北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司(石家莊店)。提取方法同文獻(xiàn)[4]，最終提取率為18.8%。以去離子水混懸給藥。

1.2 方法

1.2.1 慢性束縛應(yīng)激模型制備 大鼠束縛于特制的T型束縛架上，束縛架由導(dǎo)師課題組設(shè)計(jì)：上端束縛臺(tái)有兩條可調(diào)節(jié)松緊的粘帶，用于固定動(dòng)物胸、腹部；下面是支架，高15 cm。束縛應(yīng)激方法同文獻(xiàn)[4]。束縛時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)，每天連續(xù)3 h束縛制備應(yīng)激大鼠模型。實(shí)驗(yàn)前和開始實(shí)驗(yàn)后每周稱量1次大鼠體質(zhì)量、攝食量。于束縛前30 min進(jìn)行灌胃，正常組每天灌服0.9%生理鹽水；7 d模型組大鼠每天束縛應(yīng)激3 h連續(xù)7 d，同時(shí)灌服0.9%生理鹽水；21天模型組大鼠每天束縛應(yīng)激3 h連續(xù)21 d，同時(shí)灌服0.9%生理鹽水；逍遙散組大鼠每天束縛應(yīng)激3 h連續(xù)21 d，同時(shí)灌服逍遙散[3.854 g/(kg·d)]。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)前1 d和實(shí)驗(yàn)開始后第7、21天觀測(cè)各組大鼠行為學(xué)。

1.2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 長(zhǎng)×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm曠場(chǎng)箱，底面平分為20 cm×20 cm小正方格的25格。動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡由上海欣軟信息科技有限公司提供的行為學(xué)記錄分析軟件(Version 2.0)分析：大鼠5 min內(nèi)活動(dòng)總路程。

1.2.2.2 高架十字實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮由兩條相對(duì)的開放臂、兩條相對(duì)的封閉臂、一個(gè)聯(lián)結(jié)四條臂的中央平臺(tái)組成。行為學(xué)記錄分析軟件分析5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開放臂、封閉臂的次數(shù)和停留時(shí)間。

1.2.3 ELISA方法檢測(cè)大鼠血清D-木糖 每組12只大鼠取血2 mL(2管)，離心，分離血清，-20 ℃下保存待測(cè)。按照試劑盒說明書步驟操作測(cè)定血清D-木糖含量(間苯三酚法)，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 免疫熒光雙染觀測(cè) 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH、ob-R蛋白表達(dá)水平

1.2.4.1 取材與染色步驟 7 d組于7 d取材，21 d組于實(shí)驗(yàn)第22天取材。各組隨機(jī)取6只大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35～0.40 mL/100 g體質(zhì)量)，行左心室升主動(dòng)脈心臟灌注固定，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水。Leica CM1950恒溫冷凍切片機(jī)切片，片厚25 μm。

免疫染色具體步驟：1)切片用0.01M PBS漂洗后，加入含0.5%TritonX-100的0.01M PBS液，37 ℃，溫箱孵育1 h；2)0.01M PBS漂洗，加入封閉液，室溫孵育，搖床輕搖1 h；3)吸出封閉液，加入1∶100的Rabbit anti-α-MSH polyclonal antibody，4 ℃冰箱孵育，過2夜；4)從冰箱取出室溫平衡30 min，配制漂洗液漂洗；5)加入1∶200的Alexa Fluor@ 594 donkey anti-rabbit IgG，避光，室溫孵育4 h；6)0.01M PBS漂洗，加入封閉液，室溫孵育，輕搖1 h；7)吸出封閉液，加入1∶50的Goat anti-ob-R polyclonal antibody，入4 ℃冰箱孵育，過2夜；8)從冰箱取出，室溫平衡30 min，漂洗液漂洗；9)加入1∶200的Alexa Fluor@ 488 donkey anti-goat IgG，室溫孵育4 h；10)0.01M PBS漂洗，防熒光淬滅封片劑封片。染色過程中涉及到用0.01M PBS漂洗過程，均為每次5 min，漂洗3次；封閉液為含10% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01M PBS；漂洗液為含2% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01M PBS，均每次漂洗5 min，漂洗3次；Ⅰ抗Ⅱ抗稀釋液為含2% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01MPBS。

Donkey serum，購自Millipore Corporation，USA；Goat anti-ob-R polyclonal antibody購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，USA；Rabbit anti-α-MSH antibody購自Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，USA；Alexa Fluor@ 594 donkey anti-rabbit IgG和Alexa Fluor@ 488 donkey anti-goat IgG均購自Thermo Fisher，USA。

1.2.4.2 圖像處理 使用Leica SP8激光共聚焦顯微鏡掃描成像，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每組10張切片，下丘腦ARC部位選取150 μm×150 μm面積，統(tǒng)計(jì)α-MSH、ob-R陽性表達(dá)面積(area，μm2)、積分光密度(Intergral optical density，IOD)、陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)(SUM)，及ob-R和α-MSH共染程度(Pearson′s correlation coefficient)。數(shù)據(jù)處理：Area=area測(cè)量值/測(cè)量總面積，IOD=IOD測(cè)量值/測(cè)量總面積。

1.2.5 RT-qPCR方法檢測(cè)各組大鼠下丘腦ob-R mRNA、α-MSH mRNA表達(dá)

1.2.5.1 取材、總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增 每組6只大鼠，予10%水合氯醛腹腔麻醉，斷頭，剝?nèi)∪X，液氮速凍，干冰環(huán)境下切取ARC組織。每個(gè)樣本取約50 μg勻漿，采用TRIzol(購自Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)常規(guī)操作提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定RNA純度(OD260/OD280比值在1.8～2.0之間)，表明提取的RNA純度較高，污染很少，可后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

根據(jù)a M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Promega Corporation，Madison，USA)說明，將1 μg總RNA轉(zhuǎn)錄生成cDNAs。然后根據(jù)SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒(Fermentas Inc.，Canada)采用ABI 7300 Real-time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物：GAPDH，F(xiàn)orward：5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，Reverse：5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′，NM_017008，120bp；Ob-R，F(xiàn)orward：5′-GCCAAAGTCAACTACGCTCTT-3′，Reverse：5′-CTTCCATACGCAAACCCA-3′，NM_012596.1，133bp；a-MSH，F(xiàn)orward：5′-CAAGTTCCGCCAGAAACAG-3′，Reverse：5′-TTGCCTTAGCCCTTCGGT-3′，NM_012982.3，116bp。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min，然后40個(gè)循環(huán)反應(yīng)：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，于每個(gè)循環(huán)的第3個(gè)步驟，即：72 ℃ 30 s收集熒光信號(hào)。

1.2.5.2 結(jié)果分析 擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入SDS V1.3軟件結(jié)果分析界面，設(shè)置基線為第3～15個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參照基因，設(shè)置對(duì)照組的第1號(hào)樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，得到各樣本各目的基因的Ct值。按照公式RQ=2-△△Ct計(jì)算各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 21.0的一般線性模型(general linear model，GLM)的重復(fù)測(cè)量過程實(shí)現(xiàn)對(duì)重復(fù)測(cè)量資料體重、攝食量、行為學(xué)數(shù)據(jù)的單變量方差分析，并用多因素方差分析過程實(shí)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上組間的兩兩比較(LSD法)，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用LSD法進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和攝食量變化 見表1、表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各組大鼠攝食量變化比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

束縛應(yīng)激前，3組大鼠體質(zhì)量、攝食量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。束縛第7、14、21天，在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)21 d模型組大鼠體重明顯低于正常大鼠(P<0.01)；束縛第7、21天，在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)逍遙散組大鼠體重明顯高于21 d模型組(P<0.05)。束縛第7、14、21天，在相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)21 d模型組大鼠攝食量少于正常組，第7、21天最明顯(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第7、14、21天逍遙散組大鼠攝食量均多于21 d模型組，但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠行為學(xué)變化

2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表3。從表3可以看出，束縛應(yīng)激前，各組大鼠5 min內(nèi)活動(dòng)總路程無統(tǒng)計(jì)差異，束縛造模第7天、21天，模型大鼠活動(dòng)總路程較正常大鼠減少，雖然逍遙散組大鼠5 min內(nèi)活動(dòng)總路程較模型大鼠有所增加，但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)移動(dòng)總路程

2.2.2 高架十字實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表4～表7。在實(shí)驗(yàn)第7、21天，模型大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入高架十字迷宮開放臂次數(shù)和停留時(shí)間均較正常大鼠減少，尤其束縛應(yīng)激21 d大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)減少明顯(P<0.01)；模型大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入封閉臂次數(shù)、停留時(shí)間均有所增加，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)第21天，5 min內(nèi)逍遙散組大鼠較單純應(yīng)激大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)、停留時(shí)間有所增多，尤其逍遙散組大鼠在開放臂停留時(shí)間增加明顯(P<0.01)；逍遙散大鼠進(jìn)入封閉臂次數(shù)、停留時(shí)間均較模型大鼠下降，尤其第7天逍遙散大鼠進(jìn)入封閉臂次數(shù)下降明顯(P<0.01)。

表4 各組大鼠5 min進(jìn)入開放臂次數(shù)比較(n=20，次，

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表5 各組大鼠5 min開放臂停留時(shí)間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表6 各組大鼠5 min進(jìn)入封閉臂次數(shù)比較(n=20，次，

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 血清D-木糖含量 21 d模型組(0.16±0.01 mmol/L)和逍遙散組(0.66±0.01 mmol/L)大鼠血清D-木糖水平較正常組(0.73±0.12 mmol/L)明顯下降，P<0.05；但逍遙散組大鼠血清D-木糖水平較21 d模型大鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 免疫熒光雙染觀測(cè)各組下丘腦ARC中ob-R、α-MSH蛋白水平變化 見表8～表10、圖1。

表7 各組大鼠5 min封閉臂停留時(shí)間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21天模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組大鼠下丘腦ARC中а-MSH和ob-R表達(dá)

21 d模型組和逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R的陽性表達(dá)面積、積分光密度和陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組(P<0.01)；逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R的陽性表達(dá)面積、陽性細(xì)胞數(shù)較21 d模型組明顯下降(P<0.01)。

7 d模型組、21 d模型組、逍遙散組大鼠下丘腦ARC中α-MSH的陽性表達(dá)面積、平均光密度、積分光密度、陽性細(xì)胞數(shù)均較正常組升高，尤其21 d模型組大鼠α-MSH的陽性表達(dá)面積和逍遙散組α-MSH的積分光密度增加明顯(P<0.01)。逍遙散組α-MSH雖然較模型組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

21 d模型組大鼠ob-R與α-MSH共表達(dá)系數(shù)較正常大鼠明顯增加(P<0.01)，逍遙散組的共染程度低于21 d模型組，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表8 各組大鼠下丘腦ARC中ob-R表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表9 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表10 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH、ob-R共表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 RT-qPCR法觀測(cè)各組大鼠下丘腦ARC ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達(dá)變化

表11 各組大鼠下丘腦ARC ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達(dá)比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21天模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

從表11可以看出，與正常組比較，7 d模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA與α-MSH mRNA表達(dá)均增加，其中ob-R mRNA表達(dá)變化更為明顯(P<0.01)；21 d模型組和逍遙散組大鼠下丘腦ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達(dá)均較正常大鼠明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與21 d模型組比較，逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)，α-MSH mRNA表達(dá)雖然也較21 d模型大鼠下降，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

由于束縛制動(dòng)可模擬人被長(zhǎng)期限制在狹小空間，與人類心身疾病過程相似，屬于純粹的心理挫折應(yīng)激[6]。本研究采用束縛制動(dòng)方式制備心理應(yīng)激動(dòng)物模型，以逍遙散為干預(yù)用藥，以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字實(shí)驗(yàn)客觀觀測(cè)大鼠的自主活動(dòng)能力、對(duì)新奇環(huán)境的探究行為，分析應(yīng)激動(dòng)物出現(xiàn)的心理狀態(tài)，結(jié)合大鼠攝食、體重和外觀皮毛色澤等的變化，首先觀測(cè)了慢性束縛應(yīng)激21 d大鼠相關(guān)變化及灌服逍遙散后的反應(yīng)。

本研究中，隨著束縛應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，21 d模型組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，攝食量較正常組大鼠下降；行為學(xué)表現(xiàn)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中5 min大鼠活動(dòng)總路程減少，高架十字實(shí)驗(yàn)中大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和停留時(shí)間減少，進(jìn)入封閉臂次數(shù)和時(shí)間增加，說明大鼠自主活動(dòng)能力下降，探究性行為減少，對(duì)新異環(huán)境產(chǎn)生了恐懼、郁悶心理；伴隨應(yīng)激因素的持續(xù)施加，模型大鼠由最初的強(qiáng)烈掙扎反抗，到后期的倦怠懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、毛色枯澀、大便溏結(jié)不調(diào)的表現(xiàn)；結(jié)合模型大鼠血清D-木糖含量明顯下降，說明胃腸消化吸收功能亦下降。綜合表明，心理應(yīng)激因素的施加首先刺激大鼠出現(xiàn)狂躁、焦慮的情緒反應(yīng)，但隨著應(yīng)激因素的持續(xù)施加，逐漸出現(xiàn)了郁悶、挫折心理反應(yīng)和胃腸功能失調(diào)的內(nèi)在變化。采用中藥復(fù)方逍遙散干預(yù)的應(yīng)激大鼠，其體重、攝食量、皮毛色澤、行為學(xué)均得到一定的改善，與課題組之前報(bào)道[3-4,7]一致。方藥反證，也說明每天3 h連續(xù)21 d捆綁束縛方式可制備慢性應(yīng)激肝郁脾虛樣大鼠模型。

ob-R是瘦素(Leptin)的高親和力受體，屬I類細(xì)胞因子超家族。功能性ob-R廣泛表達(dá)于下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、室旁核、室周核及下丘腦外側(cè)區(qū)的神經(jīng)元[8-9]，這些區(qū)域是調(diào)節(jié)攝食和體重的重要區(qū)域。其中ARC在能量代謝調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮主要作用[10]。

ARC內(nèi)的Neuropeptide Y(NPY)/Agout-related peptide(AgRP)神經(jīng)元和Proopiomelanocortin(POMC)/Cocain and amphetamine-regulated transcript(CART)神經(jīng)元，前者能增強(qiáng)食欲、抑制能量消耗；后者所分泌的POMC的降解產(chǎn)物α-MSH可起到抑制食欲和促進(jìn)能量消耗的作用。功能性ob-R與NPY/AgRP和POMC/CART神經(jīng)元共存[11]，下丘腦ARC中的ob-R被Leptin激活，作用于這兩類神經(jīng)元，可抑制NPY/AgRP神經(jīng)元產(chǎn)生和釋放NPY、AgRP，另一方面則可促進(jìn)POMC神經(jīng)元產(chǎn)生和釋放α-MSH，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝、攝食行為和體質(zhì)量平衡等[12-13]。α-MSH是一種具有強(qiáng)烈的中樞性抑制攝食、促進(jìn)能量消耗作用的神經(jīng)肽[14-15]。

本課題組前期研究表明，慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致進(jìn)入下丘腦的Leptin水平增高，刺激功能性ob-R表達(dá)增加，Leptin和ob-R特異性地結(jié)合，破壞了下丘腦“食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)”的平衡[4]。在前期基礎(chǔ)上，本研究重點(diǎn)觀測(cè)了ARC中ob-R和α-MSH蛋白與基因表達(dá)情況，進(jìn)一步研究慢性應(yīng)激影響脾胃功能的中樞神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制及逍遙散疏肝健脾調(diào)節(jié)食欲的作用靶點(diǎn)。

本研究通過RT-qPCR法、免疫熒光雙染方法檢測(cè)了模型大鼠下丘腦ARC中ob-R和α-MSH表達(dá)變化，結(jié)果表明隨著束縛應(yīng)激因素的持續(xù)施加，21 d模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R和α-MSH蛋白和基因表達(dá)，及ob-R和α-MSH共表達(dá)均高于正常組，逍遙散則具有相應(yīng)的下調(diào)其表達(dá)作用。說明，外周進(jìn)入下丘腦的Leptin與ob-R結(jié)合后引起大鼠體重和攝食量下降機(jī)制與通過調(diào)節(jié)下丘腦弓狀核α-MSH通路有關(guān)，這也可能為慢性應(yīng)激狀態(tài)下逍遙散疏肝健脾，調(diào)節(jié)機(jī)體食欲和能量代謝影響脾胃功能的作用靶點(diǎn)之一。

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(2017-02-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Mechanism of Xiaoyaosan Decoction on ob-R and α-MSH in arcuate nucleus of hypothalamus of chronic restraint stress modeling rats with liver depression and spleen deficiency

Kuang Xiangnan1, Wang Shaoxian1, Fang Chaoyi1, Wang Jiepeng1, Chen Jiaxu2, Liu Yueyun2

(1HebeiCollegeoftraditionalChinesemedicine,Shijiazhuang050200,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,SchoolofBasicMedicalSciences,Beijing100029,China)

Objective:To study the mechanism of Xiaoyaosan Decoction in regulating appetite by soothing liver to relieve depression, and invigorating spleen. Methods:SD male rats were randomly divided into four groups; the control group (A), the 7-day model group (B), the 21-day model group (C) and the Xiaoyaosan (XYS) group (D). Except for the control group, models of the other three groups were established by chronic restraint stress method 3 h a day persistently for 7 days, 21 days and 21 days respectively, while Xiaoyaosan Decoction was given in the XYS group at the same time. Body weight, food intake, animal behavior, and the level of D-xylose in the serum were detected in all four groups; the mRNA and protein levels of leptin receptor(ob-R) and-melanocyte stimulating hormone(-MSH) were measured by RT-qPCR and immunofluorescence double staining method. Results:Compared with the control group, the body weight, food intake and the level of D-xylose in the serum were significantly decreased in group C, with decreased autonomous activity and new environment exploratory behavior; while the result of group D showed that Xiaoyaosan Decoction could regulate all of those mentioned above. All together indicated that chronic restraint animal model with liver depression and spleen deficiency can be established by restraining 3 h a day, for 21 days continually; the expression of ob-R and-MSH increased in arcuate nucleus (ARC) of chronic restraint stress rats and Xiaoyaosan Decoction could reduce the expression. Conclusion:The expression of ob-R and-MSH can be regulated by Xiaoyaosan Decoction, indicating that ob-R and-MSH may be the targets of Xiaoyaosan Decoction in regulating the function of spleen and stomach through soothing the liver and invigorating the spleen so as to regulate appetite and energy metabolism.

Chronic Stress; Xiaoyaosan Decoction; Liver depression and spleen deficiency; Leptin Receptor (ob-R);-melanocyte Stimulating Hormone (-MSH)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81202644；81673881；81630104)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：H2016423049)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(編號(hào)：20121323120016)；河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：QN2014118)

王少賢，女，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:muhudie@163.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.003