時(shí) 濤，李超萍，蔡吉苗，李博勛，黃貴修

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101）

一個(gè)預(yù)測(cè)的木薯衰老相關(guān)基因的獲得及其功能分析

時(shí) 濤，李超萍，蔡吉苗，李博勛，黃貴修

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101）

根據(jù)水稻LRR類抗病基因Xa21的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物，提取木薯抗/感細(xì)菌性萎蔫病種質(zhì)E1340和GR911的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增均獲得大小約0.5 kb的擴(kuò)增片段。兩個(gè)片段克隆、測(cè)序后獲得完全一致的474 nt序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)木薯種質(zhì)AM560帶有與該序列高度同源的核苷酸片段。提取包括同源片段上下游各約2.2 kb的大片段序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該片段位于1個(gè)預(yù)測(cè)基因內(nèi)，命名為SLR1。該預(yù)測(cè)基因ORF全長(zhǎng)1 641 nt，編碼546 aa，與已報(bào)道的衰老相關(guān)蛋白具有較高的同源性，可能在木薯衰老相關(guān)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

木薯；衰老相關(guān)基因；功能分析

木薯（Manihot esculenta crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，起源于熱帶美洲地區(qū)［1］。木薯具有粗生易長(zhǎng)的特點(diǎn)，目前已在全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛種植，是約10億人口的主食。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)國(guó)際木薯總產(chǎn)量穩(wěn)步上升，接近3億t［2］。1820年前后，木薯從東南亞傳入我國(guó)廣東地區(qū)，目前已在華南地區(qū)廣泛種植，北京、河北、山東地區(qū)也進(jìn)行了引種試驗(yàn)。木薯在我國(guó)最初供食用或做飼料，目前主要用作工業(yè)原料，可生產(chǎn)變性淀粉、乙醇等大量產(chǎn)品［3］。據(jù)國(guó)家木薯產(chǎn)業(yè)體系的統(tǒng)計(jì)，2014年我國(guó)木薯種植面積約39.27萬(wàn)hm2，鮮薯總產(chǎn)量893.63萬(wàn)t［4］。隨著我國(guó)木薯加工業(yè)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)木薯產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足產(chǎn)業(yè)所需，每年均需從東南亞和非洲等地區(qū)進(jìn)口大量的木薯干片及淀粉，我國(guó)是世界上最大的木薯進(jìn)口國(guó)［5］。

病害防控是木薯種植中的重要問(wèn)題之一。世界范圍內(nèi)木薯病害有30多種［6］，我國(guó)有3類9種，其中細(xì)菌性萎蔫病為害最為嚴(yán)重，其次為褐斑病和疫霉根腐?。?-9］。選用抗病品種能夠有效地減輕病害發(fā)生，是常用的防控措施之一。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)木薯抗細(xì)菌性萎蔫病方面的研究較少，也并未獲得可用的基因資源，嚴(yán)重影響了抗病育種工作的進(jìn)行。在植物抗病反應(yīng)中，相關(guān)基因調(diào)控著一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮著核心作用，大量抗病基因已得到克隆和功能鑒定［10］。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)已克隆的抗病基因編碼產(chǎn)物均具有保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)該類保守域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行抗病基因類似序列（Resistance gene analogs，RGAs）的分離，再?gòu)闹泻Y選潛在的抗病基因，稱為類似序列法，近年來(lái)在相關(guān)研究中得到廣泛應(yīng)用。本研究根據(jù)水稻抗病基因Xa21的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從木薯中分離了一個(gè)預(yù)測(cè)的衰老相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試木薯品種 木薯種質(zhì)E1340和GR911，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所木薯種質(zhì)資源圃提供，盧昕等［11］已證明E1340為抗細(xì)菌性萎蔫病種質(zhì)，GR911為高感種質(zhì)。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 Taq酶、dNTPs、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、DNA 片段膠回收試劑盒、pMD19-T 載體，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（參照方中達(dá)［12］的方法制備），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴(kuò)增 田間采集健康木薯葉片，參照閆慶祥等［13］的方法提取基因組DNA。根據(jù)水稻抗白葉枯基因Xa21的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物Pl-F （SYGTWGGAYARGWRGGAG-3′）和Pl-R （5′- AACARTCCRR YMYWTGGT-3′），參照王潔［14］的反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，按說(shuō)明書進(jìn)行產(chǎn)物的回收和克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 目的基因預(yù)測(cè)和功能分析 參照李超萍等［15］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴(kuò)增

提取木薯抗病種質(zhì)E1340和感病種質(zhì)GR911基因組作為模板，分別用引物對(duì)Pl-F和Pl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得大小約0.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）?；厥铡⒖寺?、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列完全一致，長(zhǎng)度均為474 nt。

圖1 引物對(duì)Pl-F和Pl-R的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 目的基因的預(yù)測(cè)和功能分析

2.2.1 序列的同源性比對(duì) 采用Blastx對(duì)所獲序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明其與已報(bào)道的蒺藜苜蓿、柏樹、豌豆、百合等植物的衰老相關(guān)蛋白的同源性在50%以上（表1）。

表1 所獲序列同源性比對(duì)結(jié)果

2.2.2 目的基因預(yù)測(cè) 將所獲序列和木薯種質(zhì)AM560的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，序列一致性為99%的同源片段，獲得包括該片段上下游各約2.2 kb的大片段序列，采用Softberry（http：//www.softberry.com）的Hevea（橡膠樹）、Arabidopsis（擬南芥）2種模式和GENSCAN （http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）的Maize（玉米）模式進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）均表明該同源片段位于一個(gè)預(yù)測(cè)基因內(nèi)部，該基因暫命名為SLR1。參照同屬大戟科作物的Hevea模式分析結(jié)果，該基因位于負(fù)鏈上，有10個(gè)外顯子，TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）位于第1個(gè)外顯子前約0.2 kb處，ORF全長(zhǎng)1 641 nt，編碼546 aa。

2.2.3 目的基因保守結(jié)構(gòu)域分析 利用SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）、NCBI 中CDD數(shù)據(jù)庫(kù)和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SLR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因蛋白產(chǎn)物不具有LRR類抗病基因特有的結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖2 幾種預(yù)測(cè)模式對(duì)目的基因SLR1的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.4 目的基因蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)分子量為59.16 ku，等電點(diǎn)為9.19，平均疏水性（GRAVY）為-0.086。各氨基酸中，絲氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量最高，分別為65個(gè)（9.9 %）、57個(gè)（10.84 %）和56個(gè)（7.23 %），色氨酸和谷氨酰胺含量最低，分別為7個(gè)（2.07 %）和8個(gè)（1.69 %）。TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html ）預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SLR1所編碼蛋白在第3～24、80～100、219～241、241～262、306～326、335～359、352～373個(gè)氨基酸殘基間存在7個(gè)由內(nèi)到外的跨膜螺旋區(qū)域，在第3～15、81～100、219～239、239～262、306～329、356～373、440～457個(gè)氨基酸殘基間存在7個(gè)由外到內(nèi)的跨膜螺旋區(qū)域（圖4）。

2.2.5 目的基因蛋白產(chǎn)物的聚類分析 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，SLR1基因和來(lái)自蒺藜苜蓿的幾個(gè)預(yù)測(cè)衰老相關(guān)蛋白具有較高的同源性，其中XP_013443002.1的同源性最高，為49%。與部分近源蛋白序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明來(lái)自蒺藜苜蓿的6個(gè)預(yù)測(cè)衰老相關(guān)蛋白XP_013443002.1、XP_013442995.1、XP_013442969.1、XP_013442966.1、XP_013442997.1和XP_013442963.1為一個(gè)分枝，與SLR1同源性最高；來(lái)自大豆的預(yù)測(cè)蛋白GLYMA_13G019300（KRH17828.1）和花生的預(yù)測(cè)蛋白（XP_016164677.1）為親緣關(guān)系較近的一個(gè)分枝，而來(lái)自百合的預(yù)測(cè)衰老相關(guān)蛋白（ABO20851.1）和來(lái)自柏樹的預(yù)測(cè)衰老相關(guān)蛋白（ACA30301.1）為親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的一個(gè)分枝（圖5）。

圖3 利用SMART（A）、NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（B）和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（C)）分析SLR1基因結(jié)構(gòu)結(jié)果

圖4 SLR1跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

圖5 SLR1基因氨基酸序列的聚類分析

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)水稻抗白葉枯基因Xa21的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，分別以抗、感細(xì)菌性萎蔫病的木薯種質(zhì)E1340、GR911的DNA為模板，均擴(kuò)增得到完全一致的474 nt序列。該序列和木薯種質(zhì)AM560的基因組序列比對(duì)后獲得一個(gè)預(yù)測(cè)基因SLR1，其ORF全長(zhǎng)1 641 nt，編碼546 aa。該基因蛋白產(chǎn)物不具有LRR類抗病基因特有的結(jié)構(gòu)域，絲氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量最高，色氨酸和谷氨酰胺含量最低，預(yù)測(cè)有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)和聚類分析表明，該基因和預(yù)測(cè)的衰老相關(guān)蛋白有較高的同源性。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)木薯種質(zhì)中均帶有SLR1或其同源基因，表明該基因可能在衰老相關(guān)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

目前，采用類似序列法從植株中分離獲得大量的RGAs，很多是抗病基因的一部分或者與其是緊密連鎖的。例如亞麻的4個(gè)RGAs位于抗條誘病復(fù)合N基因簇［16］，是抗病基因的一部分，而核桃中的部分NBS類RGAs僅存在于抗炭疽病核桃品種中，與抗病性相關(guān)［17］。Elízabeth等［18］從木薯中分離得到兩個(gè)RGAs，與其木薯抗細(xì)菌性萎蔫病QTL連鎖，其中1個(gè)在受到病原侵染5 d后表達(dá)，而另外1個(gè)是組成性表達(dá)的。李超萍等［15］也從木薯中獲得1個(gè)具有NBS類抗病基因保守區(qū)的預(yù)測(cè)抗病基因。有些RGAs和抗病反應(yīng)不相關(guān)，本研究所獲預(yù)測(cè)基因SLR1不具備抗病基因的結(jié)構(gòu)特征，而是和衰老相關(guān)蛋白具有較高的同源性。

衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育的最后一個(gè)階段，是植株在細(xì)胞、組織、器官或整株水平上生長(zhǎng)衰退的過(guò)程，受基因調(diào)控并受內(nèi)外環(huán)境因素影響［19］。葉片衰老是植物衰老的主要表現(xiàn)形式，是由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡的過(guò)程［20］，該階段葉片的主要功能是將生物大分子降解形成的營(yíng)養(yǎng)元素輸送至新生器官，供進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育或儲(chǔ)存［21-22］。衰老和抗病反應(yīng)之間是密切相關(guān)的，例如衰老相關(guān)蛋白在菊花受白銹?。?3］、玉米受立枯絲核菌［24］、小麥?zhǔn)軛l銹?。?5］、苧麻受根腐線蟲［26］侵染后，表達(dá)量均出現(xiàn)了差異變化。SLR1基因是否通過(guò)參與衰老相關(guān)反應(yīng)而調(diào)控木薯和細(xì)菌性萎蔫病的互作機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

［1］黃潔，周建國(guó). 木薯間套作與高效利用技術(shù)［M］. ?？冢汉Ｄ铣霭嫔纾?015.

［2］Food and agriculture organization of the united Nations. Food outlook，biannual report on global food markets［Z］. 2014.

［3］陳麗珍，葉劍秋. 我國(guó)木薯加工業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與展望［J］. 園藝與種苗，2011（3）：87-90.

［4］國(guó)家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系. 木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展報(bào)告［Z］. 2014.

［5］盤歡. 亞洲11 國(guó)木薯生產(chǎn)概況［J］. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2009（5）：29-31.

［6］李開(kāi)綿，黃貴修. 木薯主要病蟲害［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008.

［7］李超萍，時(shí)濤，劉先寶，等. 國(guó)內(nèi)木薯病害普查及細(xì)菌性萎蔫病安全性評(píng)估［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（1）：116-121.

［8］盧昕，李超萍，裴月令，等. 木薯疫霉根腐病病原初步鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34（8）：59-62，85.

［9］陳奕鵬，時(shí)濤，蔡吉苗，等. 木薯新發(fā)藻斑病在中國(guó)的發(fā)生調(diào)查及病原鑒定［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，37（9）：1787-1792.

［10］董繼新，董海濤，李德葆. 植物抗病基因研究進(jìn)展［J］. 植物病理學(xué)報(bào)，2001，31（1）：1-9.

［11］盧昕，李超萍，時(shí)濤，等. 國(guó)內(nèi)603份木薯種質(zhì)對(duì)細(xì)菌性枯萎病抗性評(píng)價(jià)［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33（4）：67-70，90.

［12］方中達(dá). 植病研究方法［M］. 第3版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［13］閆慶祥，黃東益，李開(kāi)綿，等. 利用改良CTAB法提取木薯基因組DNA［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（4）：30-32.

［14］王潔. 水稻白葉枯病抗性相關(guān)基因及抗病基因類似序列的克?。跠］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［15］李超萍，樊春俊，時(shí)濤，等. 木薯一個(gè)假定的NBS類抗病基因的獲得及其功能分析［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33（12）：35-40.

［16］Dodds P N，Lawrence C X J，Ellis J C X. Contrasting modes of evolution acting on the complex N locus for rust resistance in flax［J］. Plant J. ，2001，27 （5）：439-453.

［17］安海山，楊克強(qiáng). 核桃NBS類抗病基因類似物的序列特征及其與炭疽病的抗性［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（2）：344-356.

［18］E lí zabeth C N，Camilo L C. Expression of two resistance gene candidates against cassava bacterial blight in cassava［J］. Acta biol. Colomb.，2008，13（2）：175-188.

［19］Norbert Brugiè re，F(xiàn)rédéric Dubois，Céline Masclaux，et al. Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco（Nicotiana tabacum L.）leaves suggests that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol［J］. Planta，2000，211（4）：519-527.

［20］楊征，蔡陳崚，宋運(yùn)淳．植物細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26 （5）：439-443.

［21］Izumi M，Hidema J，Makino A，et al. Autophagy contributes to nighttime energy availability for growth in Arabidopsis［J］. Plant Physiol，2013，161（4）：1682-1693.

［22］Tegeder M. Transporters involved in source to sink partitioning of amino acids and ureides：opportunities for crop improvement［J］. J Exp Bot，2014，65（7）：1865-1878.

［23］王順利. 菊花白銹病綜合防治及菊花抗病相關(guān)基因研究［D］. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

［24］馬永毅. 立枯絲核菌AG1-IA誘導(dǎo)玉米基因差異表達(dá)分析及防衛(wèi)酶活性檢測(cè)［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［25］萬(wàn)翠萍. 小麥應(yīng)答條銹病菌冬孢子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組學(xué)分析［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

［26］劉慧玲. 苧麻根腐線蟲誘導(dǎo)的SSH文庫(kù)構(gòu)建及EST分析［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

Obtaining and function analysis of predicted senescence-associated gene from cassava

SHI Tao，LI Chao-ping，CAI Ji-miao，LI Bo-xun，HUANG Gui-xiu
（Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101，China）

One pair of degenerated primers was designed based on the conserved domain of resistance gene Xa21，which had LRR-liked domain and came from rice. The genome DNA of cassava germplasm E1340 and GR911 was extracted and used as template，which was resistant and susceptible to cassava bacterial blight separately. Two products of about 0.5 kb were obtained by PCR reaction. These two products were purified，cloned and sequenced，and then the same sequences of 474 nt were got. This sequence was highly matched with the homology segment anchored on the genome of cassava germplasm AM560. The long segment including each about 2.2 kb sequences from upstream and downstream of the homology segment was obtained，then one gene was predicted and named SLR1. Sequence analysis results of SLR1 showed that the ORF included 1 641 nucleotides encoding 546 amino acids. This predicted protein was higher consistent with senescence-associated protein reported，may play an important role in senescence mechanism of cassava.

cassava；senescence-associated gene；function analysis

Q781

A

1004-874X（2017）02-0006-06

2016-10-21

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃項(xiàng)目（0316001）；國(guó)家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-12-hnhgx）；海南省自然科學(xué)基金（20153046）

時(shí)濤（1977-），男，博士，副研究員，E-mail：shitaofly2008@163.com

黃貴修（1968-），男，博士，研究員，E-mail：hgxiu@vip.163.com

時(shí)濤，李超萍，蔡吉苗，等.一個(gè)預(yù)測(cè)的木薯衰老相關(guān)基因的獲得及其功能分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：6-11.