李夏瑩，張秀杰，宋貴文

（農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176）

轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李夏瑩，張秀杰，宋貴文

（農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的迅速應(yīng)用與發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量逐漸增加，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性也越來(lái)越被社會(huì)公眾廣泛關(guān)注，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)體系也迫切需要持續(xù)的創(chuàng)新與發(fā)展。簡(jiǎn)要介紹了轉(zhuǎn)基因作物尤其是非授權(quán)轉(zhuǎn)基因作物的成分分析檢測(cè)思路及方法，目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)主要是基于外源蛋白和核酸成分的檢測(cè)技術(shù)及方法，如酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，另外還有一些檢測(cè)新技術(shù)如指紋識(shí)別，微陣列、高通量測(cè)序等，希望對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理工作有所啟發(fā)。

轉(zhuǎn)基因生物；生物安全；檢測(cè)方法；基因型；PCR技術(shù)

從1996年至今，轉(zhuǎn)基因生物（GMO）已經(jīng)商業(yè)化20年，在此期間全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到20億hm2，相當(dāng)于中國(guó)國(guó)土面積的2倍，農(nóng)民累計(jì)獲益超1 500億美元［1］。商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要有大豆、玉米、棉花和油菜4種［2］。隨著科技的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因生物的田間試驗(yàn)和商業(yè)化速度不斷加快，轉(zhuǎn)基因涉及的物種、國(guó)家、遺傳元件的種類、國(guó)際貿(mào)易也日益增加，這就大大增加了GMO準(zhǔn)確檢測(cè)的復(fù)雜性，故對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的研究和跟蹤顯得尤為重要［3-4］。

目前轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法主要有以下四大類：一是基于核酸的檢測(cè)方法，包括基因芯片和PCR，根據(jù)原理不同PCR方法又分為普通PCR、多重PCR、巢式PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、數(shù)字PCR，以及包含交叉引物擴(kuò)增、LAMP、滾環(huán)擴(kuò)增、依賴核酸擴(kuò)增的恒溫?cái)U(kuò)增的方法［5］。二是基于蛋白的檢測(cè)方法，包括蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫層析法，但這些方法都依賴于目標(biāo)蛋白抗體的獲得，故存在一定難度。三是基于代謝物的檢測(cè)方法，包括直接分析檢測(cè)物成分的高效液相色譜法，以及雙向電泳法。四是其他的檢測(cè)方法，包括蛋白和核酸試紙條等快速檢測(cè)的方法。雖然方法很多，但是目前檢測(cè)中最常用的還是普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR的方法。

GMO的檢測(cè)方法，包含非授權(quán)GMO的檢測(cè)方法，許多國(guó)家，包括歐盟，在法律上區(qū)分授權(quán)的（合法）和非授權(quán)的（非法）GMOs。目前已有的檢測(cè)方法和篩選元件并不能涵蓋非授權(quán)的GMOs，從而會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，一些國(guó)際組織也作了一些積極的嘗試，如OECD Biotrack主動(dòng)分享數(shù)據(jù)庫(kù)里轉(zhuǎn)基因事件的相關(guān)信息，但信息的不全面仍然給GMOs的檢測(cè)和鑒定帶來(lái)了挑戰(zhàn)，特別是非授權(quán)的GMOs［6］。本文主要闡述轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法，為GMO的檢測(cè)提供參考。

1 GMO基因型和表型的檢測(cè)

目前大多數(shù)的GMO都是插入了一個(gè)外源的基因［7］，如果轉(zhuǎn)入的基因都是來(lái)源于受體物種本身，或者是能夠發(fā)生基因互換的物種，稱為基因順化。如果插入基因內(nèi)部的元素發(fā)生了重排［8］，插入的部分或全部的DNA來(lái)源于其他物種，或者受體生物不能自發(fā)基因重排，GMO被分類為轉(zhuǎn)基因［9-10］。所有GM植物的基因修飾，都是由DNA序列信息的改變來(lái)定義的［11］?；蛐揎椧矔?huì)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，但轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控很容易受到外界環(huán)境的影響，如年齡、成長(zhǎng)階段、器官、組織、細(xì)胞類型、時(shí)間（晝夜、季節(jié)）的影響。故通過(guò)轉(zhuǎn)錄分析來(lái)檢測(cè)GMO并不是普遍適用的［12］，而直接對(duì)目的DNA序列的分析才可以有效區(qū)分假陽(yáng)性和假陰性。外源基因翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也被認(rèn)為是GMO的目標(biāo)標(biāo)簽，但由于密碼子存在簡(jiǎn)并性不同的轉(zhuǎn)錄本會(huì)翻譯成相同的蛋白，且其穩(wěn)定性不好，故不太適合于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。此外，也可以根據(jù)生物的表型辨別GMO，比如某種生物獲得轉(zhuǎn)基因特性之后可以耐受除草劑。但表型識(shí)別的應(yīng)用范圍受到限制，以耐除草劑植物為例，植物在自然環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性必須要區(qū)分好轉(zhuǎn)基因的表型和自然突變。

2 GMO分析的現(xiàn)代方法

2.1 模塊化的定義

在歐洲和其他很多國(guó)家，轉(zhuǎn)基因的分析有一個(gè)完整的程序（圖1）。

圖1 GMO分析程序

分析方法是分析程序的核心，被認(rèn)為是有一系列的步驟。Holst-Jensen［13］和Trapmann等［12］指出：在歐盟的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系中，DNA是唯一具有法律效應(yīng)的被分析物。GMO檢測(cè)的程序包括樣品準(zhǔn)備、DNA提取和純化、PCR擴(kuò)增、數(shù)據(jù)分析［15］。目前通用的是根“模塊方法”，對(duì)于任何一個(gè)目標(biāo)序列均包括：樣品準(zhǔn)備、DNA提取、PCR。因此，一個(gè)模塊可以被定義為一個(gè)獨(dú)立的操作，輸入材料后，生成一個(gè)改變了的輸出材料或數(shù)據(jù)。例如：（1）在樣品準(zhǔn)備模塊：輸入的是谷物，輸出的是粉末；（2）在DNA提取和純化模塊，輸入的是粉末，輸出的是溶于水的純化DNA；（3）在real-time PCR模塊，輸入的是純化的DNA，輸出的是熒光度和目的基因的拷貝數(shù)；（4）數(shù)據(jù)分析模塊，則將有效的數(shù)據(jù)加工成為最終的測(cè)量結(jié)果。

2.2 GMO檢測(cè)的模塊

模塊方法的優(yōu)點(diǎn)在于增加了靈活性，是一種Ad Hoc設(shè)計(jì)合理的和成本有效的驗(yàn)證和測(cè)試策略。模塊方法目前主要集中于用PCR的方法分析DNA，當(dāng)然從理論上來(lái)講該方法還可以應(yīng)用于別的目標(biāo)不僅僅限于DNA。本文主要考察PCR模塊，因?yàn)樵撃K是公認(rèn)的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因分析的模塊。

每一個(gè)分析模塊最顯著的特性是其特異性，對(duì)于PCR模塊在GMO檢測(cè)中有4個(gè)水平可區(qū)分其特異性（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)化過(guò)程中4個(gè)層次明確DNA序列特異性的方法

3 檢測(cè)非授權(quán)GMOs的方法

3.1 直接檢測(cè)注冊(cè)非授權(quán)GMO

最簡(jiǎn)單的情況是個(gè)別樣品存在特定的未經(jīng)授權(quán)轉(zhuǎn)基因，如2006年拜耳作物公司由美國(guó)向歐洲出口的大米中存在未經(jīng)授權(quán)LL601事件，之后該公司緊急宣布此事件為無(wú)意釋放［14］。歐盟和挪威的官方實(shí)驗(yàn)室使用構(gòu)建特異性的檢測(cè)方法分析了此次事件中的所有大米，并很快確定了目標(biāo)，詳見(jiàn)EURL-GMFF［16］。2010年，一份來(lái)自于美國(guó)的大米接受了挪威獸醫(yī)研究所的檢測(cè)，不同于直接檢測(cè)LL601大米，樣品接受了更為廣泛的篩選分析。分析結(jié)果顯示：可能存在其他非授權(quán)的大米，即Bt63。但Bt63轉(zhuǎn)基因水稻是迄今為止只追溯到中國(guó)水稻，并且從未在亞洲以外的地方發(fā)現(xiàn)該水稻的起源。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)：該樣品中包含Bt63 （RASFF reference no. 2010.0853），之后對(duì)該事件做出了澄清：來(lái)自USA的大米在來(lái)到歐洲之后混合了來(lái)自中國(guó)的大米。所以，樣品中Bt63的真正來(lái)源是亞洲，而不是USA。如果僅僅分析材料來(lái)源，Bt63大米將永遠(yuǎn)不會(huì)被檢測(cè)到。對(duì)于非授權(quán)GMOs的檢測(cè)和分析，要綜合考慮各種因素，才可能得到準(zhǔn)確的判斷。

3.2 基于篩選由單個(gè)或少量轉(zhuǎn)基因成分的產(chǎn)品測(cè)試

以PCR方法為基礎(chǔ)的篩選方法能否覆蓋所有的授權(quán)GMOs是需要考慮的問(wèn)題。依據(jù)最近的情況，很有必要篩選更為廣泛的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行GMO篩選。如果法律規(guī)定只有官方認(rèn)定的成分應(yīng)該被考慮，那么非認(rèn)定的成分存在于樣品中也將被認(rèn)定為無(wú)關(guān)的，但這并不意味著它們不會(huì)干擾分析和混淆結(jié)果［17］。

檢測(cè)極限（LOD）是一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)。LODabs通常是目標(biāo)基因的5～10個(gè)拷貝。對(duì)于每一次試驗(yàn)，接近于LOD的濃度通常具有假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。這是在分析結(jié)果時(shí)必須要考慮進(jìn)去的。如果兩個(gè)篩查的目標(biāo)都存在GMOs，只是插入的拷貝數(shù)不同，那么相應(yīng)的LOD也會(huì)不同。完善的方法是不僅可以確定GMO是否存在，還可以確定檢測(cè)目標(biāo)的濃度。濃度可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線外推，但這樣的推算有一定的誤差?；诠_(kāi)獲得的數(shù)據(jù)做出一個(gè)合理的假設(shè)，絕大多數(shù)的GMOs插入目的基因的拷貝數(shù)的比值表現(xiàn)在1∶1至1∶5的范圍。

3.3 基于多重篩選方式的GMO檢測(cè)方法

成分復(fù)雜的樣品和（或）DNA很容易降解的樣品會(huì)給檢測(cè)帶來(lái)很大的困難。DNA降解會(huì)顯著降低GMOs的可檢測(cè)度，因?yàn)樵诓牧现心康男蛄械目截悢?shù)會(huì)減少［18］。多種組分混合會(huì)減少特定組分的相對(duì)比例，導(dǎo)致目的序列在總DNA中的比例也會(huì)降低［19］。LODpract對(duì)于任何一個(gè)GMO來(lái)說(shuō)，都是組分中DNA的完全數(shù)量，可以通過(guò)PCR分析獲得［20］， LODpract此受到過(guò)程和多種成分混合的影響。

檢測(cè)過(guò)程中存在3個(gè)難點(diǎn)：一是在低濃度的目的DNA，二是樣品成分復(fù)雜，三是不同品種的GMOs含有相同的篩選目標(biāo)。如果一個(gè)樣品中存在來(lái)自3個(gè)品種（物種）的3個(gè)篩選元件或者1個(gè)樣品中是不同GMOs雜交的品種，這就意味著篩選的結(jié)果將很難解釋［21］。故轉(zhuǎn)基因生物的篩選方法，有必要明確篩選PCR是否可以檢測(cè)出現(xiàn)有品種中所有的GMOs［17］，或任何1個(gè)品種中的GMOs是否包含檢測(cè)元件。

4 應(yīng)用于檢測(cè)的可選、先進(jìn)的技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，增加了插入不包含任何的遺傳元件的轉(zhuǎn)基因生物的數(shù)量。因此，一個(gè)生物樣品中存在著檢測(cè)模塊檢測(cè)不出來(lái)的GMO是真正的風(fēng)險(xiǎn)，建立合作專家網(wǎng)絡(luò)和研究新的檢測(cè)方法或許可以下降低風(fēng)險(xiǎn)。

4.1 指紋識(shí)別技術(shù)

Raymond等［22］概括了可用于GMO檢測(cè)和定性的有效分析工具，并探討了DNA指紋作為鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的一種替代方法［23］。從生物樣品中提取DNA，可運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出高可變位點(diǎn)（如VNTR系統(tǒng)，串聯(lián)重復(fù)的小衛(wèi)星DNA等）或者完整的基因組DNA，然后將擴(kuò)增出的DNA酶切成DNA片斷，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，按分子量大小分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上，然后將已標(biāo)記的小衛(wèi)星DNA探針與膜上具有互補(bǔ)堿基序列的DNA片段雜交，用放射自顯影獲得DNA指紋圖譜。

4.2 多重PCR結(jié)合微陣列技術(shù)

多重PCR從單一反應(yīng)中一次性檢測(cè)到多個(gè)目的基因，減少了反應(yīng)次數(shù)。但多重PCR反應(yīng)的引物、探針設(shè)計(jì)難度較大。此外，多重PCR的承載量還受到發(fā)射光和吸收光光譜的限制，因?yàn)椴煌瑹晒獾慕M合會(huì)增加熒光的背景，影響結(jié)果的判定，且重疊信號(hào)是不能被使用的。目前為止，最多可以實(shí)現(xiàn)六個(gè)熒光信號(hào)成功的標(biāo)記在同一個(gè)反應(yīng)中。在多重PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上再結(jié)合基因芯片的方法，就可以達(dá)到高通量檢測(cè)的目的［24-25］?；蛐酒╣ene chip），是一塊帶有DNA微陣列（micorarray）涂層的特殊玻璃片，在數(shù)平方厘米之面積上安裝數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)核酸探針，經(jīng)由一次測(cè)驗(yàn)，即可提供大量基因序列相關(guān)資訊。研究人員應(yīng)用基因芯片就可以在同一時(shí)間定性、定量的分析大量（成千上萬(wàn)個(gè)）的基因表達(dá)的水平，具有快速、精確、低成本之生物分析檢驗(yàn)?zāi)芰Γ?6-27］。

4.3 第三代測(cè)序技術(shù)

2008年，美國(guó)Harris等發(fā)明了一種單分子測(cè)序技術(shù)，并成功對(duì)M13病毒的基因組進(jìn)行了重測(cè)序，因此也拉開(kāi)了以單分子測(cè)序?yàn)闃?biāo)志第三代測(cè)序帷幕。目前，引領(lǐng)第三代測(cè)序的主要有通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記熒光獲得序列信息的Helicos的HeliScope遺傳分析系統(tǒng)和PacBio的SMRT技術(shù)，以及Oxford Nanopore公司的納米孔測(cè)序技術(shù)（Nanopore）等［28-30］。2011年春季在歐洲引起大量人死亡的大腸桿菌定性方面測(cè)序技術(shù)起了重要作用［31］，2015年也有文獻(xiàn)報(bào)道：測(cè)序技術(shù)有效識(shí)別未授權(quán)的GMO（高表達(dá)維生素B2的枯草芽孢桿菌）［32］。

4.4 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR （qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。該方法的原理是將核酸模板進(jìn)行稀釋，分配到大量獨(dú)立的反應(yīng)空間中，理論上使每個(gè)空間中只有一個(gè)DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，來(lái)計(jì)算目的DNA拷貝數(shù)。數(shù)字PCR采用先擴(kuò)增后定量，因此不依賴擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值（Ct），準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量分析。有研究表明：一次數(shù)字PCR反應(yīng)中可以同時(shí)準(zhǔn)確定量分析了8個(gè)不同的目標(biāo)基因（包括7個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件和玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因）［33］。

4.5 生物傳感器

轉(zhuǎn)基因作物的雜交品種（即堆疊式轉(zhuǎn)基因生物）因其生產(chǎn)效率的提高和功能的改善而日益流行，而堆疊式轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)是一個(gè)亟待解決的難題。近年來(lái)，有研究表明：多標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器可以同時(shí)檢測(cè)含多種轉(zhuǎn)基因成分的產(chǎn)品［34］。

4.6 替代PCR的前瞻性

考慮經(jīng)濟(jì)效益，無(wú)論是高密度微陣列還是下一代測(cè)序都不適合于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。然而，在不久的將來(lái)，這些技術(shù)將變得更便宜，對(duì)人員技能的要求也會(huì)降低，設(shè)備應(yīng)用越來(lái)越廣泛。因此，替代和先進(jìn)的工具逐漸將找到自己的方式，也為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

5 展望

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，新的基因編輯技術(shù)（如Talen 和CRISPR-cas9）和產(chǎn)品的出現(xiàn)，使轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)越來(lái)越困難。目前，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法是主要以目的DNA為檢測(cè)對(duì)象的PCR技術(shù)。PCR擴(kuò)增技術(shù)有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：模板DNA的質(zhì)量和引物的特異性。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品加工技術(shù)水平和加工精度的提高，模板DNA在加工過(guò)程中破壞更為嚴(yán)重，加工過(guò)程引入的物理、化學(xué)或生物性的PCR反應(yīng)抑制因子，給轉(zhuǎn)基因檢測(cè)帶來(lái)了困難。因此，為提高轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的特異性及靈敏度，需大力發(fā)展復(fù)雜樣品的核酸提取和純化技術(shù)，同時(shí)也應(yīng)發(fā)展特異性和靈敏度更高、重復(fù)性更好、檢測(cè)更快速、結(jié)果更可靠的新型核酸檢測(cè)技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商業(yè)化加快，要求在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成大量樣品的各種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，因此，高通量、自動(dòng)化、微型化、低成本、高靈敏度、高特異性、快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)及技術(shù)組合將是未來(lái)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用的發(fā)展方向。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Research progress detection methods of genetically modified organisms（GMOs）

LI Xia-ying，ZHANG Xiu-jie，SONG Gui-wen
（Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture，Beijing 100176，China）

With the rapid application and development of transgenic technology in agriculture，the categories and quantities of transgenic products progressively increased，the safety of genetically modified organisms （GMOs）has attracted more and more extensive concern of the public. Accordingly，it is very urgently needed constant innovation and development for the transgenic detection technique systems. The article briefly reviewed the common detection technology and method of GMO，especially the un-authorized GMO both in China and abroad，the existing primary detection technology and method of GMO mainly based on detection of exogenous protein and nucleic acid，such as ELISA，PCR，isothermal amplification technology and so on，there were also a number of new technologies such as fingerprint identification，microarray，high-throughput sequencing. The paper may have some inspiration to the safety management of genetically modified organisms in our country.

GMO；bio-safety；detection method；genotype；PCR

Q785

A

1004-874X（2017）02-0032-07

2016-10-09

李夏瑩（1986-），女，博士，農(nóng)藝師，E-mail：esmacloed006@163.com

宋貴文（1965-），男，高級(jí)農(nóng)藝師，E-mail：songguiwen@agri.gov.cn

李夏瑩，張秀杰，宋貴文. 轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：32-38.