劉志浩，呂 俠，宋慧一，張建斌

(1. 大連醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 大連 116044；2. 大連民族大學 生命科學學院， 遼寧 大連 116600；3. 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 中西醫(yī)結合臨床重點學科實驗室，遼寧 大連 116011)

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論 著

性質(zhì)可比自微乳處方的制備、篩選及其對白藜蘆醇增溶能力的研究

劉志浩1，呂 俠2，宋慧一3，張建斌1

(1. 大連醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 大連 116044；2. 大連民族大學 生命科學學院， 遼寧 大連 116600；3. 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 中西醫(yī)結合臨床重點學科實驗室，遼寧 大連 116011)

目的 通過制備一系列不同油相組成的自微乳處方，從中篩選出能形成相近粒徑、表面電荷和均一性微乳的可比處方，進一步考察其對白藜蘆醇的增溶能力。方法 分別以中鏈脂肪酸甘油酯、長鏈脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯為油相，通過偽三元相圖法確定微乳區(qū)，并利用納米粒度電位分析儀測定所得微乳的粒徑、多分散性和Zeta電位，從中篩選出性質(zhì)可比自微乳處方；通過HPLC測定自微乳及稀釋后微乳對白藜蘆醇的增溶能力。結果 通過篩選，選擇了4種自微乳處方，其中油相為MCT(60%)或蓖麻油(40%)的微乳處方，粒徑為140 nm左右；油相為MCT(40%)或油酸乙酯(40%)的微乳處方，粒徑為60 nm左右。所得自微乳處方對白藜蘆醇的增溶能力達到其水溶解度的8000倍左右。結論 本研究獲得了一系列具有可比性的自微乳處方：當組分相同時，所得微乳粒徑及分散性差別較大；當組分不同時，所得微乳粒徑及分散性相近，可以用于考察微乳性質(zhì)對藥物生物利用度的影響。

自微乳給藥系統(tǒng)；白藜蘆醇；增溶；粒徑；多分散性

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種天然多酚類化合物，具有多種藥理活性作用，包括抗心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老和雌性激素樣作用等[1]。由于白藜蘆醇多種有益人體的藥理作用，許多國家將其應用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領域，并將其作為膳食補充劑進行推廣，具有巨大的應用價值和市場前景。然而，溶解度過低的問題嚴重影響了白藜蘆醇的吸收。研究表明，白藜蘆醇在人體內(nèi)的口服生物利用度不足1%。針對該問題，采用新劑型技術提高其溶解度，是提高其口服生物利用度的有效手段[2]。

自諾華公司生產(chǎn)的新山地明(Neoral)上市以來，自微乳給藥系統(tǒng)(Self-Emulsifying Drug Delivery Systems，SMEDDS)的研究越來越受到關注[3]。自微乳給藥系統(tǒng)由油、表面活性劑和助表面活性劑以適當比例組成，其在胃腸蠕動或溫和攪拌下能自發(fā)形成粒徑10～200 nm、各向同性的透明或半透明O/W型分散體系[4]。自微乳給藥系統(tǒng)能顯著提高難溶性藥物(尤其是脂溶性藥物)的口服生物利用度，其機制包括提高藥物溶解度、提高藥物溶出度、增加腸滲透性、促進淋巴吸收以及抑制P-gp外排[5]。

在實際應用中，藥物口服生物利用度受到自微乳多種性質(zhì)的影響，包括自微乳組分種類，所形成微乳的粒徑、表面帶電性以及均一性，胃腸道穩(wěn)定性等[6-9]。自微乳的各個性質(zhì)對藥物口服吸收利用度的單獨影響的研究尚不深入，導致在設計自微乳處方設計主要依靠經(jīng)驗，處方篩選存在一定盲目性[10]。因此，有必要制備一系列具有可比性的自微乳，通過單因素考察各性質(zhì)對藥物吸收的影響，以更好的指導自微乳處方設計。本研究旨在制備一系列不同油相組成的自微乳處方，從中篩選出能形成相近粒徑、表面電荷和均一性微乳的性質(zhì)可比處方，并進一步考察所選處方對難溶性藥物白藜蘆醇的增溶能力，以實現(xiàn)提高其口服生物利用度的目的。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremophor RH40，藥用級，沈陽普瑞興精細化工有限公司)；中鏈甘油三酸酯 (MCT,藥用級，建德市千島精細化工實業(yè)有限公司)；油酸乙酯(Ethyl Oleate，分析純，天津光復精細化工研究所)；蓖麻油(Castor oil，化學純，天津市大茂化學試劑廠)；1,2-丙二醇(1,2-Propanediol，分析純，天津市大茂化學試劑廠)；橄欖油(Olive oil，化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(Isopropyl myristate，IPM, 化學純, 國藥集團化學試劑有限公司)；油酸(Oleic acid，化學純，天津博迪化工有限公司)；納米粒度電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，UK)；離心機(Heraeus Labofuge 400R，Thermo scientific，Germany)；磁力攪拌器(79-2，常州國華電器有限公司)；渦旋震蕩器(XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司)；高效液相色譜(Waters e2695, Milford, USA)；全溫震蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 偽三元相圖繪制

選擇聚氧乙烯氫化蓖麻油作為表面活性劑，1,2-丙二醇作為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性按照2∶1(w/w)的比例混合，作為混合表面活性劑(Smix)。將Smix和MCT分別按照9∶1，8∶2, 7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9(w/w)的比例加入到玻璃小瓶中。將上述混合物置于磁力攪拌器上攪拌2 h，使其混合均勻。最后取1 g上述混合物，并逐滴加入去離子水，渦旋震蕩2 min后靜置觀察形態(tài)，觀察到藍色乳光現(xiàn)象說明為微乳態(tài)，以此繪制偽三元相圖。

1.2.2 不同油相SMEDDS的評價與篩選

分別選擇中鏈脂肪酸甘油酯(MCT)，長鏈脂肪酸甘油酯(橄欖油和蓖麻油)以及脂肪酸一元醇酯(肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯)作為油相。將聚氧乙烯氫化蓖麻油和1,2-丙二醇按2∶1(w/w)混合后，制得Smix。將MCT、橄欖油、蓖麻油、肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯分別與Smix按照9∶1，8∶2, 7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9(w/w)的比例混合后，置于磁力攪拌器上攪拌2 h，即得候選自微乳處方。

取上述處方各1 g，加入燒杯中并用99 mL去離子水稀釋100倍，置于磁力攪拌器上攪拌30 min，分別取2 mL稀釋后樣品用納米粒度電位分析儀測定所得粒子的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位。判定粒徑小于200 nm的、有淡藍色乳光的、透明或半透明溶液為微乳液。

1.2.3 性質(zhì)可比自微乳處方的制備

首先，將聚氧乙烯氫化蓖麻油和1,2-丙二醇按2∶1(w/w)混合后，制得Smix。然后將Smix與MCT以4∶6和6∶4(w/w)的比例混合，磁力攪拌2 h，制得SME-1和SME-2。將Smix分別于油酸乙酯和蓖麻油以6∶4(w/w)的比例混合，磁力攪拌2 h，制得SME-3和SME-4。

1.2.4 HPLC法測定白藜蘆醇含量

色譜條件：色譜柱為依利特SinoChrom ODS-BP C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相為甲醇-水溶液(60∶40, v/v)；體積流量為0.8 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為308 nm。

標準曲線的繪制：精確稱取白藜蘆醇原料藥5 mg，溶于適量甲醇中并定容于10 mL容量瓶中，作為白藜蘆醇儲備液。分別稱取白藜蘆醇儲備液0.02, 0.1, 0.2, 1, 2, 4 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容制刻度。按照2.1.1方法所示，分別測定所配白藜蘆醇溶液的峰面積。以峰面積(A)和白藜蘆醇質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得到標準曲線：A=171089C-162.44，r=0.9998，表明白藜蘆醇在1～200 mg/L范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積線性關系良好。

1.2.5 自微乳及稀釋后微乳對白藜蘆醇溶解度考察

分別稱取自微乳SME 1-4各1 g，以及自微乳稀釋不同倍數(shù)(10倍，20倍和100倍)所得微乳各1 mL裝于1.5 mL Eppendorf 管中。將過量白藜蘆醇加入到上述自微乳和稀釋后微乳中，密封后置于全溫震蕩培養(yǎng)箱上(37 ℃，100 r/min)連續(xù)震蕩72 h。將平衡后樣品于8000 r/min轉速下離心10 min，取上清液用甲醇稀釋適當倍數(shù)，采用1.2.4所示方法測定白藜蘆醇在上述自微乳和不同稀釋倍數(shù)下所得微乳中的溶解度。

2 結 果

2.1 中鏈脂肪酸甘油酯作為油相

先按照1.2.1所示方法繪制了偽三元相圖(如圖1A)，在偽三元相圖繪制過程中發(fā)現(xiàn)，隨著水相加入，油/表面活性劑混合物首先形成W/O微乳，再形成凝膠態(tài)，最后當水相含量達到一定比例(>40%)時形成O/W微乳。當稀釋倍數(shù)達到100倍，若MCT∶Smix比值低于或等于6∶4，得到均一、穩(wěn)定、流動性好且?guī)в械{色乳光的微乳液。若MCT : Smix比值高于6∶4則形成乳白色不透明的乳液。我們分別考察了MCT∶Smix為0∶10，1∶9，2∶8, 3∶7，4∶6，5∶5，6∶4時稀釋100倍后所得微乳的粒徑(如圖1B所示)，發(fā)現(xiàn)隨著油相含量的增加微乳粒徑從20 nm逐漸增大到140 nm，同時所得微乳液的多分散性低于0.4。

A:MCT為油相的偽三元相圖；B:不同MCT含量時的微乳粒徑和多分散系數(shù)圖1 偽三元相圖及不同MCT含量時的微乳粒徑和多分散系數(shù)Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of MCT as oil phase and particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different MCT

2.2 長鏈脂肪酸甘油酯作為油相

長鏈脂肪酸甘油酯蓖麻油和橄欖油均與Smix按照比例混合稀釋后，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，蓖麻油: Smix比值高于4∶6時，形成白色不透明乳液；低于或等于4∶6時，形成穩(wěn)定、均一的微乳液。如圖2A所示，蓖麻油微乳粒徑在20～140 nm之間，且隨蓖麻油含量增多而增大。相似的，橄欖油: Smix比值高于2∶8時，形成白色不透明乳液；低于或等于2∶7時，形成<60 nm的微乳液。當橄欖油含量達到30%時，形成350 nm的乳白色乳液(圖2B)。相比中鏈脂肪酸甘油酯，長鏈脂肪酸甘油酯所得微乳粒徑較大且分散性也較大。

2.3 非甘油三脂肪酸酯作為油相

非甘油三脂肪酸酯肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯均與Smix按照比例混合并稀釋后，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，肉豆蔻酸異丙酯(或油酸乙酯) ∶Smix比值高于4∶6時，形成白色不透明乳液；低于或等于4∶6時，形成穩(wěn)定、均一的微乳液。如圖3所示，肉豆蔻酸異丙酯微乳和油酸乙酯微乳的粒徑均在100 nm以內(nèi)，并且隨著肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯含量增加，微乳粒徑略有增大。

A:蓖麻油；B:橄欖油圖2 不同油相含量時的微乳粒徑和多分散系數(shù)Fig 2 Particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different oil phase

A:肉豆蔻酸異丙酯；B:油酸乙酯圖3 不同油相含量時的微乳粒徑和多分散系數(shù)Fig 3 Particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different oil phase

2.4 處方選擇

通過比較上述微乳的粒徑和多分散性系數(shù)，確定油相為MCT(40%和60%)，油酸乙酯(40%)和蓖麻油(40%)的自微乳處方，可以作為性質(zhì)可比自微乳處方(處方組成見表1)。如圖4A所示，40% MCT自微乳組和 40%油酸乙酯自微乳相比，所得微乳粒徑大小和多分散性相近，具有可比性；而60% MCT自微乳和40%蓖麻油自微乳相比，所得微乳粒徑大小和多分散性相近，具有可比性。此外，4組處方所得微乳的zeta電位均在-10～-7 mV之間(圖4B)。

表1 4種自微乳處方的組成

A:粒徑及多分散系數(shù)；B:Zeta電位圖4 4種微乳的粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位Fig 4 Particle sizes, polydispersity indexes and zeta potentials of four microemulsions

2.5 自微乳處方對白藜蘆醇增溶能力考查

所選4種自微乳及其不同稀釋倍數(shù)下(10倍，20倍和100倍)所得微乳對白藜蘆醇溶解度與水溶解度的對比如圖5所示。白藜蘆醇在去離子水中的溶解度僅為10 μg/g，但是在自微乳中溶解度接近80 mg/g，為其水溶解度的8000倍。稀釋后，所得微乳對白藜蘆醇的增溶能力隨著稀釋倍數(shù)逐漸下降，即使稀釋100倍后，白藜蘆醇在微乳中溶解度依然比水溶解度高100倍以上。

圖5 白藜蘆醇在水、自微乳和稀釋微乳中的溶解度Fig 5 Solubilities of resveratrol in water, SMEDDS and the diluted microemulsions

3 討 論

近幾十年，自微乳給藥系統(tǒng)用來提高藥物口服生物利用度越來越受到關注，研究自微乳口服后提高藥物生物利用度的機制也日益深入。但是自微乳給藥系統(tǒng)制備工藝的的角度如何設計出使藥物高效吸收的自微乳處方依舊很困難[11-12]。目前，已有研究表明自微乳性質(zhì)對藥物口服生物利用度有顯著性影響，包括微乳粒徑大小、均一性、微乳穩(wěn)定性以及油相/表面活性劑組成等。本實驗目的在于制備一系列具有可比性的自微乳處方，通過制備一系列不同油相類型(中鏈脂肪酸甘油酯、長鏈脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯)的微乳液，從中篩選一系列性質(zhì)可比自微乳處方：當油相類型相同時，所得微乳粒徑及分散性差別較大；當油相類型不同時，所得微乳粒徑及分散性相近。該性質(zhì)可比自微乳處方可以分別單因素比較油相類型和粒徑大小的影響。通過篩選確定4種自微乳處方，其中SME-2, SME-3和SME-4采用相同的油/表面活性劑/助表面活性劑比例，但油相種類分別為中鏈脂肪酸甘油酯、長鏈脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯；SME-1和SME-4粒徑相近(約140 nm)而SME-2和SME-3粒徑相近(約60 nm)。最后考察了所得4種自微乳對難溶性藥物白藜蘆醇的增溶能力，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在4種自微乳中的溶解度是水溶解度的近8000倍，稀釋以后的微乳依然能很有效的提高白藜蘆醇的溶解度。理論上，所得的4種自微乳處方能有效的提高白藜蘆醇的生物利用度。通過比較4種自微乳處方載白藜蘆醇的吸收情況，可以確定微乳油相類型和粒徑大小對其提高藥物生物利用度的具體影響。

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Preparation and selection of comparable self-microemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) and their solubilizing capabilities on resveratrol

LIU Zhihao1, LYU Xia2, SONG Huiyi3, ZHANG Jianbin1

(1.CollegeofPharmacy，DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China；2.CollegeofLifeScience，DalianNationalitiesUniversity，Dalian116600，China；3.KeyLaboratoryofIntegrativeMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To prepare and select comparable self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS) formulations with similar particle sizes，zeta potentials and polydispersity indexes and to detect their solubilizing capabilities on resveratrol. Methods We prepared a series of SMEDDS formulations composed of medium-chain triglycerides, long-chain triglycerides and non-triglycerides. Their particle sizes, polydispersity indexes and zeta potentials were studied by Zetasizer Nano ZS90, and selected the comparable SMEDDS formulations. The solubilizing capability of the selected SMEDDS formulations on resveratrol was detected by HPLC. Results The formulations containing 60% MCT or 40% castor oil as oil phase could form microemulsions of diameter 140 nm; while the formulations containing 40% MCT or 40% ethyl oleate could form microemulsions of diameter 60 nm. The solubilities of resveratrol in the four SMEDDS formulation were about 8000-fold of that in water. Conclusion If the compositions of SMEDDS were the same, the particle sizes and polydispersity indexes varied significantly, while if the composition of SMEDDS were different, the particle sizes and polydispersity indexes were similar. The obtained SMEDDS formulation could be applied to study the effect of SMEDDS properties on the drug bioavailability.

SMEDDS; resveratrol; solubilizing capability; particle size; polydispersity index

10.11724/jdmu.2017.02.03

國家自然科學基金青年基金項目(81603186)；遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2016026)

劉志浩(1987-)，男，講師。E-mail：liuzhihao12399@126.com

張建斌，講師。E-mail：zhangjb@dmu.edu.cn

R944

A

1671-7295(2017)02-0116-05

劉志浩，呂俠，宋慧一，等.性質(zhì)可比自微乳處方的制備、篩選及其對白藜蘆醇增溶能力的研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(2)：116-120.

2016-12-27;

2017-03-17)