周 琪，竇同意，丁樂樂，曲明佳，翁仔淼，吳大暢，侯 潔

(1. 大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系， 遼寧 大連 116044；2. 中國科學院大連化學物理研究所 生物技術(shù)部 藥用資源開發(fā)組， 遼寧 大連 116023)

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論 著

β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

周 琪1，竇同意2，丁樂樂1，曲明佳1，翁仔淼1，吳大暢1，侯 潔1

(1. 大連醫(yī)科大學 生物技術(shù)系， 遼寧 大連 116044；2. 中國科學院大連化學物理研究所 生物技術(shù)部 藥用資源開發(fā)組， 遼寧 大連 116023)

目的 構(gòu)建表達β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)的重組菌株，得到高純度β-葡萄糖醛酸酶，進而對黃芩苷進行生物轉(zhuǎn)化獲得黃芩素。方法 以E.coliK12基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增GUS基因，經(jīng)酶切后連接到表達載體pET-28a中，獲得重組表達載體pET28a-GUS，將重組載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，對所得基因工程菌進行培養(yǎng)條件和表達條件的優(yōu)化；后經(jīng)分離純化后得到高純度β-葡萄糖醛酸酶。以黃芩苷為底物進行酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃芩素，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果 經(jīng)測序，擴增的重組質(zhì)粒目的基因序列與數(shù)據(jù)庫中GUS基因序列一致。經(jīng)IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside)誘導(dǎo)表達后， SDS-PAGE分析獲得分子質(zhì)量70 kDa的單一蛋白條帶，工程菌最適培養(yǎng)條件為： 37 ℃、pH7.2、IPTG濃度0.6 μmol/L、誘導(dǎo)時間12 h。經(jīng)過離心破碎、親和層析、凍干后得到高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉。在該酶催化轉(zhuǎn)化下，黃芩苷可轉(zhuǎn)化為黃芩素，在40 ℃，pH 6.5，酶濃度60 μg/mL條件下，反應(yīng)2.5 h，黃芩苷轉(zhuǎn)化率可達72.5%。結(jié)論 成功構(gòu)建了β-葡萄糖醛酸苷酶高表達菌株，并用于黃芩苷的定向水解制備黃芩素，為生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)黃芩素提供了新思路。

黃芩素；酶解；黃芩苷；β-葡萄糖醛酸苷酶

黃芩是傳統(tǒng)中藥，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有抗菌，抗炎，抗病毒、抗腫瘤等作用[1-2]。黃芩中含有多種黃酮類化合物：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等20余種成分[1-3]。其中，黃芩苷經(jīng)口服進入腸道后，在腸道內(nèi)經(jīng)腸道菌水解為黃芩素被吸收入血，進而發(fā)揮作用[4-5]。臨床藥效實驗證明，黃芩素比黃芩苷具有更強的生理活性[1,6]。目前，黃芩素的制備方法主要有以下3種：(1)從藥材黃芩中分離提?。?2)水解黃芩苷制備黃芩素；(3)黃芩苷生物轉(zhuǎn)化制備黃芩素[7-8]。在黃芩中，黃芩素含量低(一般在0.1%～0.5%之間)，直接提取分離收率很低。采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)黃芩素反應(yīng)溫和，易于控制，且無環(huán)境污染[9]。目前，國內(nèi)已報道多種微生物用于黃芩素的生物制備，如黑曲霉[8]、人腸道菌[4]、白腐真菌[10]、米曲霉[11]等。由于黃芩苷為β-葡萄糖醛酸苷，苷元為黃芩素。在β-葡萄糖醛酸酶的催化作用下，黃芩苷可定向水解為黃芩素(圖1)。因此，本實驗提出酶法生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，首先對β-葡萄糖醛酸苷酶基因進行克隆，并構(gòu)建β-葡萄糖醛酸苷酶基因工程菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得高純度β-葡萄糖醛酸苷酶。在此基礎(chǔ)上，建立β-葡萄糖醛酸苷酶催化體系，對黃芩苷進行生物轉(zhuǎn)化制備黃芩素。

圖1 黃芩苷生物轉(zhuǎn)化過程Fig 1 Biotransformation of baicalin to baicalein

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌E.coliK12菌株、質(zhì)粒載體pET-28a(+)、表達菌株感受態(tài)細胞JM109、BL21(DE3)、DNA Polymerase(Code No.R045A)、Nde I和Xho I限制性內(nèi)切酶、DNA純化試劑盒、5×In-Fusion HD Enzyme Premix均購自大連Takara公司。LB培養(yǎng)基瓊脂、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟(PMSF, Phenylmethanesulfonyl fluoride)、對硝基酚-β-葡萄糖醛酸苷(PNPG, p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)等均為國產(chǎn)分析純。黃芩苷、黃芩素標準品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，其他試劑為分析純。

電泳儀(Bio-rad)，高速冷凍離心機(日本日立公司)，超聲波細胞粉碎機(JY-96-Ⅱ?qū)幉粕鷥x器廠)，PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 GUS基因PCR擴增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫查找E.coliK12 GUS基因序列，并根據(jù)基因序列設(shè)計引物對將大腸桿菌E.coliK12株菌體于50 μL 裂解液(TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164))中變性后離心取上清作為模版，擴增GUS基因，反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix: 25 μL，P1 (20 pmol/μL) 1 μL，P2 (20 pmol/μL) 1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物。

引物： P1，5'-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATG-TTACGTCCTGTAGAA-3',P2，5'-GGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCATTGTTTGCCTCC-3'，劃線部分分別為Nde I和Xho I酶切位點。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-GUS

使用限制酶Nde I和Xho I對pET-28a(+)質(zhì)粒進行酶切，反應(yīng)體系如下：pET-28a(+)30 μL，10×H Buffer 5 μL，Nde I(10 U/μL)2.5 uL，Xho I(10 U/μL)2.5 μL，用ddH2O 補至總體積為50 μL，反應(yīng)條件37 ℃，16 h。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。

將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進行連接反應(yīng)制備重組表達載體pET-28a-GUS。反應(yīng)體系：質(zhì)粒 5 μL，PCR產(chǎn)物 (50 ng/μL ) 2 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，用ddH2O將體積補至10 μL。連接反應(yīng)條件：50 ℃，15 min。取連接產(chǎn)物1 μL熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆植菌，提取質(zhì)粒后對其進行測序。

1.2.3 重組β-葡萄糖醛酸苷酶在大腸桿菌中的表達

經(jīng)證實，質(zhì)粒測序結(jié)果與參考序列完全一致后，取該質(zhì)粒1 μL熱轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆菌即為重組基因工程菌。在劃線平板上選取陽性重組子放入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；按1%接種量轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600=0.6～0.8)時，加入IPTG至終濃度1 μmol/L，繼續(xù)在37 ℃ 搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)過夜，取出1 mL培養(yǎng)物，進行SDS-PAGE電泳分析及酶活力測定，選取酶活力及表達量最高的發(fā)酵條件進行后續(xù)實驗。

1.2.4 β-葡萄糖醛酸酶的分離純化

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取菌液于5000×g條件下離心15 min，棄上清，用PBS(pH 7.4)對沉淀進行重懸，加入PMSF(終濃度0.1 mmol/L)后于冰浴條件下超聲破碎1 h。隨后在20000×g、4 ℃條件下離心20 min，所得上清即含有目的蛋白。

使用Ni親和層析柱對目的蛋白進行親和層析，目的蛋白將隨洗脫液一起流下。收集洗脫液于透析袋中，在水中透析2次，每次1～2 h，隨后透析過夜即可，透析結(jié)束后透析袋中的蛋白會有所析出而使袋內(nèi)液體呈現(xiàn)白色。收集透析后液體于離心管中，于-80 ℃冰箱放置過夜，隨后至凍干機冷凍干燥，即得到高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉。

1.2.5 酶活力的測定

取10 μL PNPG(20 mmol/L)的PBS溶液，加入5 μL的酶溶液(10 μg/mL)，補充85 μL的PBS緩沖液，混勻后，在37 ℃條件下連續(xù)測定反應(yīng)液在405 nm條件下的OD變化值，將在37 ℃，pH 7.4條件下，每分鐘形成1 μmol pNP所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.2.6 黃芩苷轉(zhuǎn)化分析方法的建立

參照文獻[4]方法，測定轉(zhuǎn)化液中黃芩苷水解產(chǎn)物黃芩素的含量。黃芩素的測定選用紫外吸光光度法。黃芩素結(jié)構(gòu)中A環(huán)上有5,6,7三羥基結(jié)構(gòu)，經(jīng)測定黃芩素在紫外光區(qū)355 nm處有最大吸收，可通過其吸光度值來測定黃芩素生成量。以DMSO為溶劑，配制10 mmol/L 的黃芩素標準品溶液，用PBS分別稀釋到20、40、60、80、100、120、160 和200 μmol/L，然后利用酶標儀在355 nm處檢測其吸光度值，以吸光度對溶液濃度作黃芩素的標準曲線。

1.2.7 黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

取200 μmol/L的黃芩苷溶液10 μL，加入10 μL的酶溶液，補充PBS緩沖液至100 μL，混勻后，在37℃下孵育一定時間后，向反應(yīng)液中加入等體積的乙醇終止反應(yīng)，反應(yīng)體系經(jīng)高速(20000×g)離心后取上清液用甲醇稀釋后備用。以PBS為空白參照，測定離心上清液中黃芩素的吸光度值，根據(jù)黃芩素標準曲線，計算黃芩素的生成量。

1.2.8 反應(yīng)條件的優(yōu)化及確定

對以下6個因素：pH、接種比、培養(yǎng)時間、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度(表1)，使用minitab 17 軟件的實驗設(shè)計部件對蛋白表達的最適條件進行實驗設(shè)計和探究，得出因子回歸方程。對不同誘導(dǎo)時間點的總酶活力、細菌密度和總蛋白濃度進行測定，探究誘導(dǎo)時間與總酶活力之間的關(guān)系。

按照表2中的試驗因素和水平進行正交設(shè)計。選擇L9(34)正交表作為實驗方案(表3)進行條件優(yōu)化。通過單因素實驗確定正交試驗的設(shè)計范圍，優(yōu)化黃芩甘苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，并進行正交試驗。

表2 實驗因素和水平Tab 2 Factors and levels in orthogonal array design for reaction optimization

表3 正交試驗優(yōu)化方案Tab 3 Orthogonal assay for reaction optimization

2 結(jié) 果

2.1 β-葡萄糖醛酸酶的重組表達

2.1.1 GUS基因的克隆與序列分析

瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物的分子量約為1.8 kb(圖 2)，擴增目的基因序列與數(shù)據(jù)庫中GUS基因(GenBank accession no: NC_000913.3)序列一致。

圖2 GUS基因的PCR擴增結(jié)果Fig 2 PCR amplification of GUS gene

2.1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達純化

將重組菌株誘導(dǎo)表達前后的粗酶提取物(未經(jīng)純化的β-葡萄糖醛酸酶，含雜質(zhì))進行SDS-PAGE分析(圖3a)，結(jié)果表明，與誘導(dǎo)前相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后酶的表達量明顯提高，且分布于細胞裂解液中(圖3a，條帶3)。經(jīng)鎳親和色譜進一步純化后得到蛋白，并進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明蛋白條帶清晰單一，大小約為70 kDa，與目標蛋白相符，且純度較高(圖3b)。

a:1和2條帶分別為未誘導(dǎo)細胞裂解液的上清和沉淀；3和4條帶分別為誘導(dǎo)細胞裂解液的上清和沉淀。b:1～6條帶為依次被洗脫下的后β-葡萄糖醛酸苷酶，7條帶為純化前的粗酶液。 M 均為蛋白marker 圖3 裂解細胞和β-葡萄糖醛酸苷酶純化酶的SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analyze of lysis cell and β-glucuronidase

2.1.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

使用minitab 17軟件對實驗結(jié)果進行分析，條件1～8(表1)誘導(dǎo)的粗酶液總酶活力分別為471.4 U,2988 U,2177.1 U,2338.2 U,1256.3 U,1028.5 U,2948.5 U,1332 U，可知誘導(dǎo)時間是粗酶液總酶活力的顯著性影響因素(圖4a)。對實驗結(jié)果進行回歸分析，其因子回歸方程如下：酶液活力(U)=-10393+1170A+104.2B+60.42C+594.6D+397.7E+300.1F-37.27A*F。其中A: pH; B: 接種比(mL); C: 培養(yǎng)時間 (h); D: IPTG 濃度 (μmol/L); E: 誘導(dǎo)時間 (h); F: 誘導(dǎo)溫度 (℃)。

a：誘導(dǎo)時間對總酶活力的影響；b：IPTG濃度對總酶活力影響圖4 誘導(dǎo)時間和IPTG濃度對總酶活力的影響Fig 4 Effect of induction time and IPTG concentration on the total enzyme activity

2.1.4 誘導(dǎo)表達條件的確定

當誘導(dǎo)時間為8 h時蛋白濃度達到最高，而誘導(dǎo)時間為12 h時總酶活力達到最高(圖5a和b)，并且此時菌處于穩(wěn)定期生長。因此，β-葡萄糖醛酸苷酶表達的最適條件為37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h，在此條件下可以從1 L培養(yǎng)液中獲得320 mg高純度β-葡萄糖醛酸酶凍干粉純酶。

a：誘導(dǎo)時間對總酶活力及細菌密度的影響，1為總酶活力，2為細菌密度；b：誘導(dǎo)時間對總酶活力及總蛋白濃度的影響，1為總酶活力，2為總蛋白濃度圖5 誘導(dǎo)時間對蛋白表達及酶活力的影響Fig 5 Effect of the induction time on the protein expreesion and enzyme activity

2.2 黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

2.2.1 黃芩苷轉(zhuǎn)化分析方法的建立

對黃芩素和黃芩苷進行了吸收波長波譜掃描，黃芩素最大吸收峰出現(xiàn)在355 nm處(圖6a)，而在相同情況下黃芩苷幾乎沒有吸收(圖6b)。利用酶標儀檢測355 nm處吸光度值，并以吸光度對溶液濃度作黃芩素的標準曲線，以進行反應(yīng)體系中黃芩素的定量檢測。

a：黃芩素和黃芩苷吸收波長波譜；b：黃芩素的標準曲線圖6 黃芩素檢測方法的建立Fig 6 Analysis method for the biotransformation

2.2.2 優(yōu)化轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件

正交試驗結(jié)果可以看出，采用A3B3C3方案確定底物轉(zhuǎn)化效率最高的反應(yīng)條件。即在底物濃度為200 μmol/L，pH為6.5，酶濃度為60 μg/mL，反應(yīng)溫度為40 ℃時，經(jīng)過2.5 h的孵育后黃芩苷的轉(zhuǎn)化率最高，可達72.5%。見表4。

表4 黃芩苷轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化Tab 4 Condition optimization of the baicalin biotransformation to baicalein

3 討 論

生物轉(zhuǎn)化是一種高效和具有選擇性的溫和催化體系，酶及酶體系能將許多天然化合物轉(zhuǎn)化為具有高生物活性物質(zhì)。酶法生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素，可以獲得更高效、更穩(wěn)定的活性物質(zhì)。黃芩苷結(jié)構(gòu)中包含黃芩素苷元和1個分子葡萄糖醛酸，利用β-葡萄糖醛酸苷酶或產(chǎn)酶菌可對黃芩苷進行生物轉(zhuǎn)化，得到黃芩素。β-葡萄糖醛酸苷酶是一種酸性水解酶，黑曲霉[8]、人腸道菌E.coli[4]、白腐真菌[10]、米曲霉均可作為野生型產(chǎn)酶菌，在發(fā)酵過程中將黃芩苷作為底物，對其催化水解。然而微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵液成分復(fù)雜，分離純化困難，往往收率較低。通過對β-葡萄糖醛酸苷酶基因進行克隆制備得到高效產(chǎn)酶菌，進而獲得高純度酶粉，對黃芩苷進行酶催化水解，體系穩(wěn)定且有利于黃芩素的分離提取。

鑒于β-葡萄糖醛酸苷酶在野生E.coli中高度表達，本研究通過對野生型E.coliK12中的β-葡萄糖醛酸苷酶基因進行克隆表達，使用pET-28a(+)作為質(zhì)粒載體，最終將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主菌種，構(gòu)建了基因工程菌。通過對比發(fā)酵后，野生型及工程菌中發(fā)酵液及破碎后菌體中的蛋白成分，發(fā)現(xiàn)野生型發(fā)酵液及裂解液中，蛋白成分均比較復(fù)雜，將為β-葡萄糖醛酸苷酶的純化帶來困難；而工程菌細胞裂解液中，β-葡萄糖醛酸苷酶為單一蛋白成分，有利于蛋白的進一步分離純化。使用鎳柱親和層析對酶進行純化，得到高純度的凍干酶粉。以上結(jié)果說明通過基因克隆及誘導(dǎo)表達，獲得了目標單酶。

工程菌發(fā)酵過程中，蛋白在誘導(dǎo)早期迅速積累并容易形成結(jié)構(gòu)折疊錯誤、無功能的蛋白，而在誘導(dǎo)后期由于營養(yǎng)缺乏使菌體處于應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)構(gòu)折疊錯誤的蛋白進行重新折疊形成結(jié)構(gòu)正確、功能完整的蛋白[12]。因此，為了探究誘導(dǎo)時間與總酶活力之間的關(guān)系，對不同誘導(dǎo)時間的總酶活力、細菌密度和總蛋白濃度進行了考察。通過實驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶最適條件為37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol//L IPTG誘導(dǎo)12 h，在此條件下可以從1 L培養(yǎng)液中獲得320 mg純酶。

將上述分離得到的β-葡萄糖醛酸苷酶用于黃芩苷的催化水解中，得到黃芩素。通過前期對單一條件實驗確定正交試驗的設(shè)計范圍，采用A3B3C3方案對反應(yīng)進行優(yōu)化。最終確定底物濃度為200 μmol/L，pH為6.5，酶濃度為60 μg/mL，反應(yīng)溫度為40 ℃時，經(jīng)過2.5 h的孵育后黃芩苷的轉(zhuǎn)化率最高，可達72.5%。在3種因素中，溫度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響最大，pH影響較小，而酶濃度的增加有利于轉(zhuǎn)化率的提高。由于產(chǎn)物黃芩素本身對酶活性可能存在一定的抑制關(guān)系，延長反應(yīng)時間并不能明顯提高黃芩苷的轉(zhuǎn)化率。在前期工作中，我們利用C18WAX固相萃取柱可以實現(xiàn)葡萄糖醛酸苷和苷元的快速分離，由于黃芩苷與黃芩素兩者存在類似的結(jié)構(gòu)差異[13]，因此，可以利用此方法進行分離純化產(chǎn)物黃芩素，在后續(xù)研究中將體系中黃芩素的分離提純進行優(yōu)化，為黃芩素的生物制備提供條件。

本研究成功構(gòu)建了表達β-葡萄糖醛酸苷酶的高產(chǎn)菌株，并得到高純度β-葡萄糖醛酸苷酶，成功對黃芩苷進行催化水解獲得黃芩素，并建立了利用β-葡萄糖醛酸苷酶對黃芩苷進行生物轉(zhuǎn)化的方法。本方法成本低、對環(huán)境無污染，為生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素提供了新的思路。

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Bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase in Escherichia coli

ZHOU Qi1, DOU Tongyi2, DING Lele1, QU Mingjia1, WENG Zimiao1, WU Dachang1, HOU Jie1

(1.DepartmentofBiotechnology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

Objective To develop a novel and environmental-friendly method for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase. Methods Theβ-glucuronidase encoding gene (GUS) was cloned fromEscherichiacoliwild strain K12, and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) with pET-28a (+) as the vector.β-Glucuronidase was overexpressed and then purified by Ni affinity chromatography in one step. The biotransformation of baicalin to baicalein was performed by the recombinantβ-glucuronidase, and the reaction conditions were optimization with orthogonal design. Results The protein was identified by SDS-PAGE with 70 kDa, and the maximum expression level could be achieved after induction for 12 h with 0.6 μmol/L IPTG, and 320 mg of purified enzyme, which could be obtained from one liter of bacterial culture. With the catalysis of the recombinantβ-glucuronidase, the baicalin was transformed to baicalein with 72.5% conversion ratio under optimized conditions. Conclusion A novel and environmental-friendly scheme for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase was established. The method would hold great promise for further applications in both scientific research and biomedical industry.

baicalein;biosynthesis; baicalin;β-glucuronidase

10.11724/jdmu.2017.02.02

國家自然科學基金項目(81273590，81302793);精細化工國家重點實驗室開放課題(KF1408)

周 琪(1988-)，女，助理實驗師。E-mail: zhouqi@dmu.edu.cn

侯 潔，副教授。E-mail: houjie@nankai.edu.cn

Q819; R284.3

A

1671-7295(2017)02-0110-06

周琪，竇同意，丁樂樂，等.β-葡萄糖醛酸苷酶的重組表達及對黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(2)：110-115.

2016-12-14；

2017-03-28)