武小斌，穆淑梅，趙玲玉，康現(xiàn)江，薛建民

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.衡水市畜牧水產(chǎn)局 水產(chǎn)技術推廣站，河北 衡水 053000)

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日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)4個野生群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析

武小斌1，穆淑梅1，趙玲玉1，康現(xiàn)江1，薛建民2

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.衡水市畜牧水產(chǎn)局 水產(chǎn)技術推廣站，河北 衡水 053000)

為了評價不同地區(qū)日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)野生群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平，利用微衛(wèi)星標記對白洋淀、衡水湖、微山湖和洪澤湖4個地區(qū)日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性進行分析.結(jié)果顯示，22對微衛(wèi)星位點都顯示具足夠的多態(tài)性；每個野生群體中至少有6個位點顯示雜合不足，顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡；4個日本沼蝦野生群體均表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性，其中微山湖野生群體遺傳多樣性水平相對較高，其他3個野生群體的遺傳多樣性水平則相對較低；群體間F-統(tǒng)計量(Fst)及分子方差分析表明，4個日本沼蝦野生群體間存在中等程度的遺傳差異(0.046 3

日本沼蝦；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，俗稱青蝦或河蝦，廣泛分布于湖泊、池塘和江河中，是一種經(jīng)濟價值較大的淡水蝦類，白洋淀、衡水湖、微山湖、洪澤湖都有日本沼蝦野生資源的分布[1].因其肉質(zhì)細嫩，美味可口，富含維生素、氨基酸以及Mn、Zn等多種人體必需微量元素，并有一定藥用價值，深受人們喜愛并得到廣泛養(yǎng)殖.據(jù)《中國漁業(yè)年鑒》公布，近幾年全國養(yǎng)殖日本沼蝦年產(chǎn)量約2×105t，年產(chǎn)值近100億元，其養(yǎng)殖已成為我國農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑之一.近年來，隨著迅速推進的工業(yè)化進程，日本沼蝦野生群體的棲息地環(huán)境受到人為干擾、破壞和無序開發(fā)，使得其群體結(jié)構遭到嚴重破壞，種質(zhì)純度降低，資源量銳減，日本沼蝦的種質(zhì)資源保護亟需得到重視.本文擬通過對白洋淀、衡水湖、微山湖、洪澤湖日本沼蝦野生群體種質(zhì)資源現(xiàn)狀的分析研究，為日本沼蝦優(yōu)良種質(zhì)資源保護及遺傳選育研究提供數(shù)據(jù)支持.

研究物種群體的遺傳結(jié)構與變化規(guī)律即群體遺傳學[2]，它是利用分子實驗技術結(jié)合生物統(tǒng)計學方法研究特定群體中基因(型)頻率和變化情況，從而了解物種群體內(nèi)(間)的基因交流情況.分子標記作為群體遺傳學研究重要工具得到越來越廣泛的應用[3-5]，其中微衛(wèi)星標記(simple sequence repeat，SSR)具有重復性好、多態(tài)性信息豐富、數(shù)量多等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于水產(chǎn)動物的遺傳多樣性分析、數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus,QTL)定位和功能基因發(fā)掘等研究[6-8].

1 材料與方法

1.1 日本沼蝦的獲得與形態(tài)學數(shù)據(jù)測定

選取4個采樣點(河北白洋淀、河北衡水湖、山東微山湖、江蘇洪澤湖)獲得日本沼蝦野生群體樣本，采樣點見表1.鮮活樣品采集后，解剖取肌肉保存于體積分數(shù)為95%的酒精中，-20 ℃冰箱中保存.

表1 4個日本沼蝦野生群體采樣數(shù)據(jù)概況

1.2 基因組DNA提取

解剖日本沼蝦取肌肉組織50mg，采用海洋動物DNA提取試劑盒(康維世紀，CW2089S)提取基因組DNA.DNA質(zhì)量濃度與質(zhì)量通過NanoDrop2000C超微量分光光度計進行測定，根據(jù)測定結(jié)果將所有樣品的DNA質(zhì)量濃度調(diào)整為50ng/μL， 10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的純度及降解程度，合格DNA樣品-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 微衛(wèi)星PCR反應

本研究所采用的22對微衛(wèi)星引物均由本實驗室自行設計開發(fā)，引物序列見表2.PCR反應體系為10μL，包括：5μL2×EsTaqMasterMix；1μLDNA模板(50ng/μL)；1μL上游引物和下游引物，RNase-FreeWater補齊.采取梯度PCR方法，確定合適退火溫度(表2)，以減少非特異性條帶.PCR反應條件：1)95 ℃變性 4min；2)94 ℃熱變性 30s，各自退火溫度下復性 30s，72 ℃延伸 30s，共進行35個循環(huán)；3)72 ℃延伸10min；4)PCR產(chǎn)物4 ℃保存.獲得的PCR產(chǎn)物通過15g/L瓊脂糖凝膠電泳進行初步檢測合格后，用80g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行微衛(wèi)星多態(tài)性檢測.

1.4 統(tǒng)計學分析

通過QuantityOne凝膠圖像分析軟件分析電泳條帶，根據(jù)條帶位置確定基因型，利用Popgene(Version1.32)軟件進行群體遺傳分析，計算等位基因數(shù)目(Na)、觀測雜合度(Ho)與期望雜合度(He)，通過U檢驗進行Hardy-Weinberg平衡測試.利用PIC-CALC軟件對各微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(PIC)進行計算.

利用ARLEQUIN 3.1計算群體遺傳分化的F-統(tǒng)計量(Fst)及分子方差分析(AMOVA).計算群體間Nei’s遺傳距離，利用MEGA 4.1軟件基于Nei’s遺傳距離構建UPGMA系統(tǒng)進化樹.釆用軟件Structure 2.3.4進行群體結(jié)構分析，估算每個個體的遺傳構成及其所屬的亞群，并繪制群體遺傳結(jié)構圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 4個日本沼蝦野生群體遺傳多樣性

通過22對微衛(wèi)星引物對4個日本沼蝦野生群體進行遺傳多樣性分析，所有的微衛(wèi)星位點都顯示足夠的多態(tài)性，圖1為MN05引物在4個群體中的擴增結(jié)果，擴增后各個位點等位位點數(shù)及座位多態(tài)信息含量如表2. 22個引物擴增共獲得183個等位位點，等位位點數(shù)在4～14，平均等位位點數(shù)8.318 2.其中引物MN07和MN12獲得的等位位點數(shù)最多，均為14個；引物MN20和MN21均獲得4個等位位點，等位位點數(shù)最少.觀測雜合度Ho值在0.052 1～0.906 2，平均為0.458 9；期望雜合度He值在0.214 6～0.892 6，平均值為0.562 3，大于平均觀測雜合度.22個等位位點的多態(tài)信息含量PIC介于0.209 5～0.889 0，平均值為0.527 3，可有效進行遺傳多樣性分析.

位點引物序列(5'to3')退火溫度/℃NaHoHePICMN01F:CGGCGAGTGACAATGAAGR:GAAGCTCATGTTGGCTCTTAT56110.50000.47780.4581MN02F:ACAGCCATTTGTCTCAGTATCTR:TCCCAGCAGAAAGACGAG54100.41670.36400.3479MN03F:ACGAGCACCATAACAACCAR:AAATGTGATGCTGAGTGGC5780.34780.61590.5779MN04F:GGCGTTCACCTACACCACTAR:AGAAGTCCTAGATGCTGCTCTG6050.15790.25110.2420

續(xù)表2

4個日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表3.總體來看，各野生群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)接近.就近交系數(shù)(Fis)而言，4個日本沼蝦群體間存在一定的差別，其中河北白洋淀野生群體Fis最高，山東微山湖野生群體Fis最低，4個群體Fis大小順序依次為白洋淀>洪澤湖>衡水湖>微山湖，各群體Fis值均為正值.

對88個群體位點組合(4個種群×22個引物)進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，55(62.5%)個群體位點組合符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，33(37.5%)個群體位點組合則顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05).Hardy-Weinberg平衡檢驗P值結(jié)果顯示，白洋淀、衡水湖和洪澤湖群體顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的組合，都為9個，微山湖6個.

表3 日本沼蝦4個群體的遺傳多樣性統(tǒng)計

2.2 日本沼蝦群體的遺傳結(jié)構

4個群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳分化指數(shù)(Fst)如表4所示.洪澤湖和白洋淀野生群體間的遺傳距離最遠(0.167 0)；白洋淀與衡水湖野生群體間遺傳距離最近(0.078 6).4個群體的Fst均介于0.046 3～0.101 2，白洋淀與衡水湖野生群體間的遺傳分化指數(shù)最小(0.046 3)；洪澤湖和白洋淀野生群體間的遺傳分化指數(shù)最大(0.101 2).UPGMA系統(tǒng)進化樹顯示(圖2)，白洋淀和衡水湖群體聚在一起，微山湖和洪澤湖群聚在一起.分子方差分析如表5所示，4個日本沼蝦野生群體中的遺傳變異93.07%存在于群體內(nèi)，僅有6.93%的遺傳變異來自于群體間，但各野生群體間遺傳分化極顯著(P<0.01).

表4 4個日本沼蝦野生群體間的Nei’s遺傳距離(對角線上)和Fst值(對角線下)矩陣

圖2 4個地理群體遺傳聚類分析結(jié)果Fig.2 UPGMA clustering tree of Macrobrachium nipponense based on Nei’ s genetic distance among the four populations

變異來源自由度平方和變異組分變異比例/%群體間375.2860.39716.93*群體內(nèi)個體間92555.1460.699412.20*個體內(nèi)96445.0004.635480.87*總變異1911075.4325.7319

*經(jīng)過1 000次模擬檢驗后極顯著(P<0.01).

本實驗設置了100 000個burnin運算長度，預設1～10個假設K值，即群體的理論劃分數(shù)目，每個K值重復運算10次，通過不同假設K值下的DeltaK值確定最適K值，圖3為分別在K=2、3、4的情況下4個群體的遺傳結(jié)構圖.STRUCTURE軟件分析結(jié)果顯示，當K=2時，白洋淀群體和衡水湖群體聚為一簇，微山湖群體和洪澤湖群體聚為一簇，與遺傳發(fā)育樹結(jié)果相似，分為北方群體和南方群體.當K=3時，白洋淀群體和洪澤湖群體被獨立集群，因此從遺傳學角度可以把它們看作不同群體.當K=4時，4個群體多數(shù)個體歸于各自集群.

圖3 日本沼蝦群體在不同假設K值下的遺傳結(jié)構Fig.3 STRUCTURE genetic cluster analysis for the four populations of Macrobrachium nipponense(K=2—4)

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

遺傳多樣性水平是群體種質(zhì)資源評價的重要依據(jù)，而高水平的遺傳多樣性表明群體具有良好的生存能力和繁殖潛力[9].在本研究中，4個野生群體平均觀測雜合度介于0.435 7～0.502 1，高于淮河群體(0.222～0.330)[10]，低于黃河群體(0.470 5～0.573 1)[11]和太湖群體(0.750 0～0.822 2)[12].本實驗所得結(jié)果與黃河、千島湖、太湖日本沼蝦種群遺傳多樣性研究結(jié)果類似[11-13]，部分群體-位點組合顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，這種現(xiàn)象極有可能是隨機變化和/或小樣本量所引起.在本實驗中，考慮到He明顯高于Ho，雜合子缺失可能是偏離Hardy-Weinberg平衡最有力的證據(jù)[14].通過比較Ho和Hardy-Weinberg平衡，可以推斷本實驗研究的4個地區(qū)日本沼蝦野生群體生長在合適的水域環(huán)境中，表明日本沼蝦野生群體還保留著相當高的遺傳多樣性.

3.2 群體遺傳結(jié)構分析

遺傳分化指數(shù)(Fst)值是揭示群體間的遺傳分化程度的重要參數(shù).Fst值在0～0.05，群體的遺傳分化水平較低；Fst值在0.05～0.15時，群體顯示中等程度的遺傳分化水平，F(xiàn)st值大于0.15時，群體顯示出較高的遺傳分化水平[15].AMOVA結(jié)果顯示，本研究中4個日本沼蝦野生群體的Fst值均介于0.046 3～0.101 2，表明4個日本沼蝦群體間存在中等程度的遺傳差異，這與其他水域日本沼蝦野生群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性研究結(jié)果基本吻合[11-13,16]，而對中國沿海7個擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)野生群體分析的Fst值介于0.035 5～0.081 7[17]；中國和泰國6個羅氏沼蝦(M.rosenbergii)養(yǎng)殖群體間的Fst值介于0.006 1～0.093 1[18]；克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)的長江下游幾個地理種群中，該值介于0.040 5～0.155 9[19]，這幾種重要的經(jīng)濟類甲殼動物野生群體的遺傳分化水平均與日本沼蝦野生群體相近.Brown等[20]研究表明異交物種90%以上的遺傳變異來自于群體內(nèi)部，本研究分子方差分析結(jié)果表明，日本沼蝦野生群體之間的遺傳變異僅占變異總數(shù)的6.93%，部分的遺傳變異來源于群體內(nèi)各個體間(12.20%)，絕大部分的遺傳變異來自于個體內(nèi)部(80.87%)，表明日本沼蝦野生群體變異水平較低.根據(jù)計算出的Nei’s遺傳距離對日本沼蝦野生群體進行聚類分析，結(jié)果表明：地理位置接近的白洋淀和衡水湖群體聚類為一支；微山湖和洪澤湖群體聚類為一支，與實際的地理間隔相符，隨著距離的增大，親緣關系漸遠.可見地理距離對于日本沼蝦野生群體分化程度有較為重要的影響.同時親緣關系與生活環(huán)境和生活習性密切相關，白洋淀和衡水湖2個群體的生活環(huán)境比較封閉，且日本沼蝦本身的游泳能力有限，只做近距離游動，僅在幼苗時期隨水流動或人為因素被動擴散外，與其他野生群體的基因交流較少；南方河流分布比較密集，微山湖和洪澤湖日本沼蝦野生群體生活環(huán)境比較開放，存在著一定程度的基因交流.

STRUCTURE軟件可根據(jù)個體遺傳組成進行群體遺傳結(jié)構模擬分析，不受各實驗群體的樣本量的影響，可以作為群體遺傳結(jié)構分析的重要工具[21].STRUCTURE條形圖顯示，當K=2時DeltaK值最大，說明存在2個亞群，白洋淀群體和大部分衡水湖群體分配到1號亞群，衡水湖的少部分個體和其余2個群體中大部分個體分配到2號亞群，與4個日本沼蝦群體的聚類分析結(jié)果相符合.

通過以上分析，揭示了白洋淀、衡水湖、微山湖和洪澤湖4個地區(qū)日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀及群體遺傳結(jié)構，這些結(jié)果可為日本沼蝦優(yōu)良種質(zhì)資源保護及遺傳選育研究提供基礎數(shù)據(jù)支持.

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(責任編輯：趙藏賞)

Microsatellite analysis of genetic diversity in four wild populations of oriental river prawn(Macrobrachiumnipponense)

WU Xiaobin1,MU Shumei1,ZHAO Lingyu1,KANG Xianjiang1,XUE Jianmin2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2. Fishery Technology Extending Station, Bureau of Animal Hasbandry and Aquiculture of Hengshui,Hengshui 053000,China)

Genetic diversity and differentiation of different wild population of oriental river prawn(Macrobrachiumnipponense)in Baiyangdian Lake,Hengshui Lake,Weishan Lake and Hongze Lake,were investigated using 22 microsatellite DNA loci.The data showed that all the 22 loci were highly polymorphic.An exactP-value test indicated that most loci significantly deviated from Hardy-Weinberg in the Baiyangdian Lake,Hengshui Lake and Hongze Lake populations with the number of 9 loci,respectively；the deviations of Hardy-Weinberg were also detected in Weishan Lake populations with the number of 6 loci.All of the four wild populations showed high genetic diversities,and the genetic diversity in Weishan populations was relatively higher than the others three populations.TheFstand AMOVA analysis suggested that there was a moderate degree of genetic divergence among the four populations(0.046 3

Macrobrachiumnipponense；microsatellite；genetic diversity

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.009

2016-03-25

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系淡水養(yǎng)殖創(chuàng)新團隊項目

武小斌(1992—)，男，河北張家口人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail:hbdxwxb@163.com

康現(xiàn)江(1964—)，男，河北邯鄲人，河北大學教授，博士生導師，主要從事細胞發(fā)育分化及其調(diào)控方面的研究. E-mail:xjkang218@126.com

Q347

A

1000-1565(2017)02-0161-08