王靜，張瀟月，張競(jìng)文，竇海洋,，申世剛

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002)

?

基于場(chǎng)流分離技術(shù)分離表征血清中的脂蛋白

王靜1，張瀟月2，張競(jìng)文2，竇海洋1,2，申世剛1

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002)

采用非對(duì)稱場(chǎng)流分離系統(tǒng)與多角度激光光散射檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)分離表征冠心病患者血清中脂蛋白.研究了恒定交叉流流速和指數(shù)衰減交叉流流速對(duì)非對(duì)稱場(chǎng)流分析血清的影響.利用非對(duì)稱場(chǎng)流分離系統(tǒng)分離并收集了血清主要成分片段，通過動(dòng)態(tài)激光光散射儀對(duì)收集的樣品片段進(jìn)行了表征.研究結(jié)果表明，血清中游離的蛋白質(zhì)和脂蛋白能被非對(duì)稱場(chǎng)流分離系統(tǒng)分開；指數(shù)衰減交叉流流速不僅縮短了分析時(shí)間，而且提高了脂蛋白亞類片段的分離度.結(jié)果證明，非對(duì)稱場(chǎng)流分離與多角度激光光散射檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)是一種潛在的血清中脂蛋白的分離表征方法.

非對(duì)稱場(chǎng)流分離；血清；脂蛋白；冠心病

血清中的脂蛋白是由蛋白質(zhì)與脂質(zhì)形成的復(fù)合物，與動(dòng)脈粥樣硬化型心血管疾病之間有著密切的關(guān)系.目前，臨床上常以血液中高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)的膽固醇含量(HDL-C和LDL-C)作為冠心病的預(yù)測(cè)因子[1-3].然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物升高HDL-C水平的同時(shí)卻沒有降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4].因此單純從血液中HDL-C和LDL-C的角度評(píng)價(jià)冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在明顯的局限性.最近，Pérez-Méndez等[5]指出與HDL-C相比，血清中HDL/LDL值具有較強(qiáng)的冠心病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力.Schmidt課題組[6]發(fā)現(xiàn)小粒徑、高密度的LDL預(yù)測(cè)能力不依賴于性別、年齡、吸煙等冠心病風(fēng)險(xiǎn)因素.血清中的脂蛋白粒徑分布可能成為不受冠心病風(fēng)險(xiǎn)因素影響的新的預(yù)測(cè)因子.因此，血清中脂蛋白的分離及粒徑表征對(duì)了解冠心病的發(fā)病機(jī)理及冠心病的診斷和治療具有重要意義.然而，目前廣泛應(yīng)用于血清中脂蛋白分離的超高速離心法具有分析時(shí)間長、操作復(fù)雜等缺點(diǎn).聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)測(cè)得的血清中脂蛋白的粒徑是平均粒徑，準(zhǔn)確性低，并且無法測(cè)得脂蛋白的粒徑分布.因此，急需一種快速、準(zhǔn)確、高效的血清中脂蛋白的分離表征方法.

非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)(asymmetricalflowfieldflowfractionation,AF4)是一種基于樣品與外力場(chǎng)相互作用機(jī)理的分離表征技術(shù)[7].不同于HPLC、GPC基于樣品與固定相相互作用的分離技術(shù)，AF4池道中沒有固定相和填充材料，故AF4具有較廣泛的檢測(cè)范圍(1nm～50μm，103～1018g/mol)，適用于剪切力敏感的生物樣品的分離.AF4池道的獨(dú)特設(shè)計(jì)使分析載液具有廣泛的選擇性，進(jìn)而可對(duì)樣品進(jìn)行原位分析；收集的AF4樣品片段可用于其他分析手段的離線或在線分析.此外，根據(jù)AF4理論，AF4與一些檢測(cè)器串聯(lián)可以同時(shí)提供樣品的粒徑分布圖.這是超高速離心法和PAGE法等其他分離技術(shù)所無法比擬的.

盡管AF4已廣泛應(yīng)用于生物樣品的分離表征，但是應(yīng)用于分離血清的報(bào)道較少，最近，Moon課題組[8]報(bào)道了應(yīng)用中空纖維場(chǎng)流分離血清中的脂蛋白，但并未進(jìn)行脂蛋白粒徑分析.本文采用非對(duì)稱場(chǎng)流分離與多角度激光光散射檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)分離表征了冠心病患者血清中脂蛋白，通過非對(duì)稱場(chǎng)流分離收集了脂蛋白亞類片段，并通過動(dòng)態(tài)激光光散射對(duì)收集的片段進(jìn)行了粒徑表征.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、溴酚藍(lán)、馬脾鐵蛋白、高密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品、低密度脂蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品購自美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉、疊氮化鈉購自上海麥克林生化科技有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%鹽酸(北京化工廠)；所用試劑均為分析純，所用水為超純水.

1.2 血清制備

取8mL冠心病志愿者靜脈血，置于10mL促凝管中，多次翻轉(zhuǎn)后使用TGL-20B離心機(jī)(上海安亭分析儀器廠)離心(6 000r/min，20min).取上層清液(血清)，并在相同條件下再次離心，以確保上層清液中沒有血細(xì)胞.將制備好的血清樣品儲(chǔ)存在超低溫冰箱(-80 ℃)待AF4分析.

1.3 血清AF4分析

采用美國Wyatt公司的Eclipse2非對(duì)稱場(chǎng)流分離系統(tǒng)對(duì)血清樣品進(jìn)行分離.Eclipse2依次串聯(lián)著美國Wyatt公司的DAWNEOS多角度激光光散射檢測(cè)器(MALS)，日本島津公司的RL-10AXL熒光檢測(cè)器.載液為10mmol/L的PBS緩沖溶液，pH=7.4.為了抑制細(xì)菌產(chǎn)生，載液中加入了3mmol/L疊氮化鈉，同時(shí)加入了不同量的氯化鈉調(diào)節(jié)載液的離子強(qiáng)度.載液使用前，通過0.1μm的可再生纖維素膜過濾.載液通過美國Agilent公司的1200HPLC泵注入到AF4池道中.AF4池道長度為26.5cm，包括350μm的聚酯墊片和5KDa可再生纖維素超過濾膜.通過已知擴(kuò)散系數(shù)(D)的馬脾鐵蛋白標(biāo)樣測(cè)得的實(shí)際AF4池道高度(w)為283 μm.進(jìn)樣20 μL混合后的四名冠心病患者血清樣品.池道橫流流速設(shè)定為1.0 mL/min，交叉流流速(Vc)分別設(shè)定為恒定流速和指數(shù)衰減流速.Vc為2，3和 4 mL/min時(shí)，通過溴酚藍(lán)測(cè)定的聚集時(shí)間分別為2.1，2.0，和1.8 min.指數(shù)衰減交叉流流速和衰減時(shí)間的關(guān)系如式1所示[9]：

Qc(t)=Qc(0)·e(-ln2/t1/2)t，

(1)

其中，Qc(t)是Vc隨時(shí)間衰減函數(shù)；Qc(0)是開始時(shí)交叉流流速；t1/2是半衰期.

AF4分離主要包括樣品進(jìn)樣、聚集松弛和分離3個(gè)過程.如圖1所示，進(jìn)樣后粒子在外力場(chǎng)作用下往池道底部運(yùn)動(dòng)，同時(shí)粒子的布朗運(yùn)動(dòng)使其向池道中心擴(kuò)散.當(dāng)2種外力達(dá)到平衡時(shí)，由于粒徑小的顆粒擴(kuò)散系數(shù)大，形成的樣品層的中心位置更接近于池道中心，此位置的橫流流速較快，故粒徑小的粒子先被洗脫出來[7].根據(jù)AF4理論(式2)[10-12]，在沒有樣品與超過濾膜交聯(lián)的條件下，水動(dòng)力學(xué)直徑(dH)和保留時(shí)間(tr)具有如下關(guān)系：

(2)

其中，k為波爾茲曼常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，V0為空隙體積，η為載液黏度，Vc為交叉流流速，w為實(shí)測(cè)池道厚度，t0為空隙時(shí)間.

圖1 場(chǎng)流分離技術(shù)原理Fig.1 Principle of field flow fractionation

1.4 血清DLS表征

采用美國Wyatt公司的NanoStar動(dòng)態(tài)激光光散射粒度儀(DLS)對(duì)血清和收集的AF4血清片段進(jìn)行了粒度表征.20 μL樣品直接加入到DLS樣品池中，樣品室溫度設(shè)定為25 ℃，樣品采集時(shí)間為5 s,每個(gè)樣品采集點(diǎn)數(shù)為100，操作波長為658 nm.通過DYNAMICS V7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 血清中脂蛋白的分離

AF4分離過程中，外力源于通過超過濾膜的交叉流流速，是影響樣品AF4分離度的主要因素.圖2是不同交叉流流速熒光檢測(cè)器(FL，激發(fā)波長為288 nm，發(fā)射波長為335 nm)和90°角MALS檢測(cè)器(LS90)的血清AF4洗脫譜圖.載液包含3 mmol/L NaN3，50 mmol/L NaCl 和10 mmol/L PBS緩沖溶液，pH=7.4.由圖2a可見，當(dāng)Vc=2 mL/min時(shí)，空隙峰(t0)后面出現(xiàn)了2個(gè)洗脫峰.第1個(gè)相對(duì)強(qiáng)度較大的洗脫峰可能是一些游離的蛋白質(zhì)，第2個(gè)相對(duì)強(qiáng)度較弱并伴隨著拖尾的洗脫峰可能是脂蛋白.在60 min關(guān)閉交叉流后洗脫出來了一個(gè)小峰.這可能是由于少量較大的或是一些交聯(lián)在超過濾膜表面上的成分被洗脫出來.隨著Vc的逐漸增加，樣品的保留時(shí)間逐漸向右移動(dòng).正如AF4理論所示(式2)，在較高Vc條件下，樣品被進(jìn)一步推向池道底部，平衡時(shí)樣品層中心位置的層流流速較慢，故增加了保留時(shí)間.當(dāng)Vc=3 mL/min時(shí)，第1個(gè)洗脫峰和空隙峰完全分開，當(dāng)60 min關(guān)閉交叉流后釋放出來的峰強(qiáng)度和Vc=2 mL/min時(shí)釋放出來的峰強(qiáng)度相比沒有明顯變化，說明樣品與超過濾膜沒有發(fā)生明顯的交聯(lián).當(dāng)Vc增加到4 mL/min時(shí)，第2個(gè)洗脫峰變成了“拖尾峰”，關(guān)閉交叉流后釋放出來的峰強(qiáng)度增強(qiáng)，表明樣品與超過濾膜發(fā)生了交聯(lián).

由圖2b可以看出，當(dāng)Vc=2 mL/min，AF4-LS90顯示了3個(gè)洗脫峰；當(dāng)Vc=4 mL/min，60 min時(shí)關(guān)閉交叉流后釋放出來的峰的強(qiáng)度顯著高于熒光檢測(cè)器信號(hào)強(qiáng)度(圖2a).這主要是由于LS90信號(hào)強(qiáng)度不僅和樣品的濃度有關(guān)，而且與樣品的粒徑大小相關(guān).LS90檢測(cè)出來的第3個(gè)洗脫峰可能是粒徑較大的低密度脂蛋白.根據(jù)AF4原理(式2)，在Vc=3 mL/min條件下，將保留時(shí)間轉(zhuǎn)換成了水動(dòng)力學(xué)直徑并列于圖2b頂部x軸上.結(jié)果顯示，3個(gè)洗脫峰水動(dòng)力學(xué)直徑分別為3～10 nm，10～20 nm，20～100 nm.

圖3為不同半衰期指數(shù)衰減的交叉流流速的血清AF4-FL(a)和AF4-LS90(b)圖譜.初始交叉流流速為3 mL/min.載液為3 mmol/L NaN3，50 mmol/L NaCl 和10 mmol/L PBS緩沖溶液，pH=7.4.由圖3a可以看出，在指數(shù)衰減的交叉流流速作用下，血清中大部分成分在60 min內(nèi)被洗脫；第1個(gè)洗脫峰完全和空隙峰分開.和恒定交叉流流速相比(圖2b)，指數(shù)衰減交叉流流速半衰期t1/2=7 min時(shí)(圖3b)在保留時(shí)間為36 min時(shí)，出現(xiàn)了一個(gè)小的洗脫峰.這主要是由于MALS信號(hào)強(qiáng)度和粒子直徑有關(guān)，對(duì)于粒徑大的粒子即使?jié)舛认鄬?duì)很小，也能有較好的響應(yīng)值.隨著半衰期的增加，新出現(xiàn)的洗脫峰逐漸趨向于長的保留時(shí)間并且強(qiáng)度相對(duì)減弱.結(jié)果證明，與恒定交叉流流速相比，指數(shù)衰減的交叉流流速不僅縮短了分析時(shí)間，而且改善了粒徑大的粒子的分離度.故選擇t1/2=7 min的指數(shù)衰減的交叉流流速作為本文研究的分析條件.

圖2 不同交叉流流速的血清AF4-FL(a)和AF4-LS90圖譜、水動(dòng)力學(xué)直徑分布圖(b)Fig.2 AF4-FL fractograms(a)and AF4-LS90 fractograms hydrodynamic diameter distribution(b)of serum obtained at various cross-flow rates.

圖3 不同半衰期指數(shù)衰減的交叉流流速的血清AF4-FL(a)和AF4-LS90(b)圖譜Fig.3 AF4-FL fractograms(a)and AF4-LS90 fractograms (b) of serum obtained by exponentially decaying cross-flow rate with various half-life times

圖4為不同NaCl濃度載液的血清AF4-FL和AF4-LS90圖譜.從圖4a可以看出，隨著載液中NaCl濃度的增加，第1個(gè)洗脫峰的信號(hào)強(qiáng)度減小，第2個(gè)洗脫峰的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng).由于載液離子強(qiáng)度的增加，降低了樣品表面雙電子層的厚度，使樣品更接近于超過濾膜表面，從而提高樣品的分離度.從圖4a可以看出，隨著載液中NaCl濃度的增加，血清中粒徑大的成分(保留時(shí)間大于35 min)LS90信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低.這可能是由于粒徑大的粒子更接近于超過濾膜表面，發(fā)生了不可逆吸附.

2.2 血清中脂蛋白洗脫峰的確定

為了確定血清中脂蛋白的洗脫峰，分析了HDL和LDL標(biāo)準(zhǔn)樣品，如圖5所示.載液為3 mmol/L NaN3，25 mmol/L NaCl 和10 mmol/L PBS緩沖溶液，pH=7.4，指數(shù)衰減交叉流初始流速為3 mL/min，t1/2=7 min.由圖5a可以看出第2個(gè)洗脫峰主要成分是HDL，保留時(shí)間10 min以后洗脫出的主要成分是LDL.由圖5b可以看出，LDL標(biāo)準(zhǔn)樣品的洗脫峰包括3個(gè)成分，可能是低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、超低密度脂蛋白(VVLDL).結(jié)果證明，AF4-MALS在指數(shù)衰減交叉流流速輔助下，可以分離出低密度脂蛋白的亞類.此外，由于AF4分離不破壞樣品的物化性質(zhì)，收集的AF4樣品片段可以進(jìn)一步進(jìn)行離線或在線分析.

圖4 不同氯化鈉濃度載液的血清AF4-FL(a)和AF4-LS90(b)圖譜Fig.4 AF4-FL fractograms(a)and AF4-LS90 fractograms (b) of serum obtained with carrier liquid of various concentrations of NaCl

圖5 血清、HDL標(biāo)準(zhǔn)樣品、LDL標(biāo)準(zhǔn)樣品的AF4-FL(a)和AF4-LS90(b)圖譜Fig.5 AF4-FL fractograms(a)and AF4-LS90 fractograms (b) of serum,HDL and LDL standard samples

2.3 血清中脂蛋白的DLS表征

血清和收集的AF4血清片段(圖5b中片段F1、F2、F3和F4)的水動(dòng)力學(xué)直徑DLS表征結(jié)果見表1.從表1可以看出，長保留時(shí)間收集的片段對(duì)應(yīng)的DLS測(cè)得的水動(dòng)力學(xué)直徑相對(duì)較大，符合AF4分離原理，即粒徑較小的樣品先被洗脫出來.DLS測(cè)得的整個(gè)血清樣品的水動(dòng)力學(xué)直徑偏大.由于DLS光強(qiáng)度正比于粒子直徑的6次方，即粒徑擴(kuò)大1倍，DLS光信號(hào)強(qiáng)度擴(kuò)大106倍.因此DLS分析粒徑分布寬的樣品時(shí)，粒徑小的樣品的光強(qiáng)度往往被粒徑大的光強(qiáng)度淹沒，導(dǎo)致結(jié)果偏大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過AF4樣品預(yù)分離，可以減少DLS結(jié)果的偏差.

3 結(jié)論

AF4-MALS-FL不僅可以進(jìn)行血清中主要成分的分離，可以提供水動(dòng)力學(xué)直徑分布圖.AF4-MALS-FL在指數(shù)衰減交叉流流速輔助下，不僅縮短了血清的分析時(shí)間，而且可以分離低密度脂蛋白的亞類.由于AF4是一種溫和的分離技術(shù)，其對(duì)生物樣品的不破壞性使收集的AF4樣品片段可以進(jìn)一步分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AF4-MALS-FL是一種潛在的血清中脂蛋白的分離表征方法.

表1 血清和收集AF4片段的水動(dòng)力學(xué)直徑

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Separation and characterization of lipoproteins in serum using field flow fractionation

WANG Jing1,ZHANG Xiaoyue2,ZHANG Jingwen2,DOU Haiyang1,2,SHEN Shigang1

(1.Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China；2.College of Medicine,Hebei University,Baoding 071002,China)

The lipoproteins in serum were separated and characterized using asymmetrical flow field-flow fractionation(AF4)coupled with multiangle light scattering(MALS),and fluorescence(FL)detectors.The effect of programmed cross-flow rates in linear decay and exponential decay on the AF4 analysis of serum was studied.The collected AF4 fractions of the serum were characterized by dynamic light scattering(DLS).It was found that the free proteins and lipoproteins in the serum were separated by AF4.The application of exponentially decaying cross-flow rate not only reduced the time of AF4 analysis of serum,but also improved the resolution for the sub-class of lipoproteins.The results demonstrate that AF4-MALS-FL is a useful tool for the analysis of lipoproteins in serum.

asymmetrical flow field-flow fractionation；serum；lipoprotein；coronary artery disease

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.004

2016-12-05

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2016201002)；河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目(CL201603)；河北省高等學(xué)?？萍佳芯炕鹳Y助項(xiàng)目(QN2016081)；河北省2016醫(yī)學(xué)學(xué)科研究重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目(20160048)；保定市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(15ZG049)；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201610075071)

王靜(1992—)，女，河北臨漳人，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事場(chǎng)流分離研究.E-mail：13403204355@163.com

竇海洋(1983—)，男，河北香河人，河北大學(xué)講師，博士，主要從事場(chǎng)流分離研究.E-mail:douhaiyang-1984@163.com申世剛(1964—),男，河北阜城人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究.E-mail:shensg@hbu.edu.cn

O

A

1000-1565(2017)02-0128-06