劉建新，徐笑寒，丁華僑

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究開發(fā)中心，浙江 杭州 311202)

姜荷花種球抗寒生理生化特征及促抗寒藥劑效果

劉建新，徐笑寒，丁華僑

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究開發(fā)中心，浙江 杭州 311202)

姜荷花是國內(nèi)新興的一種熱帶花卉，但中國絕大部分地區(qū)因冬季寒冷導(dǎo)致種球不能自然越冬保存。為了明確姜荷花種球的抗寒生理，以便找出進(jìn)一步提升種球抗寒性的方法，用不同低溫脅迫處理姜荷花清邁粉種球，分析其各種生理生化指標(biāo)，并開展了種球的抗寒藥劑篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，姜荷花種球在9 ℃開始表現(xiàn)出逆境脅迫；由抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的變化可知，種球分別在5和1 ℃調(diào)動(dòng)了自身的抗逆系統(tǒng)來抵御環(huán)境的不良影響，在-3 ℃，各抗逆相關(guān)指標(biāo)基本上降低到最低點(diǎn)。抗寒藥劑篩選試驗(yàn)表明，各藥劑處理(包括脫落酸、水楊酸、蕓苔素內(nèi)酯、6-BA、多效唑等)均對(duì)增強(qiáng)姜荷花種球的抗寒性有一定作用。根據(jù)細(xì)胞受損程度分析，1 mg·L-1ABA浸泡種球處理24 h的保護(hù)效果最好；其次，0.08 mg·L-16-BA處理對(duì)膜透性有較好的保護(hù)作用，但膜脂的氧化程度較高。

姜荷花；清邁粉；種球；抗寒性；脫落酸

姜荷花(CurcumaalismatifoliaGagnep)是國際上流行的主要姜荷屬花卉種類，為多年生球根草本花卉，原產(chǎn)于泰國清邁等地，主要作為佛教用花。由于不育苞片形似荷花且為姜科，故稱為姜荷花。具備荷花和郁金香雙重之美，又稱熱帶郁金香(Summer tulip)或暹羅郁金香(Siam tulip)。目前，國外有關(guān)姜荷花的研究主要集中在地理生態(tài)分布、采后生理、花發(fā)育、花期調(diào)控、組織培養(yǎng)、同工酶多態(tài)性、遺傳多樣性、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化等。國內(nèi)姜荷花相關(guān)研究相對(duì)較少，且主要集中在生產(chǎn)應(yīng)用方面，如姜荷花的栽培、組培、切花保鮮[1]、矮化[2]、園林應(yīng)用[3-4]等。至于抗寒性方面，林金水等[5]對(duì)姜荷花植株的抗寒性進(jìn)行了研究，但有關(guān)姜荷花種球的抗寒性研究一直未見報(bào)道。由于姜荷花原產(chǎn)地在熱帶地區(qū)，種球一般都需要較高的溫度才能順利越冬，溫度較低會(huì)導(dǎo)致種球凍壞。在中國的絕大部分地區(qū)，姜荷花種球都無法自然越冬，因此，有必要使用抗寒相關(guān)藥劑來提升種球的抗寒能力。本研究選用了具有促抗寒潛力的脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、多效唑(paclobutrazol，PP333)、6-BA和油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)作為研究對(duì)象。ABA是抗寒基因表達(dá)的信號(hào)分子，對(duì)植物抗寒力的調(diào)控起重要作用，能提高植物的抗逆性[6-8]。SA是一種植物內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)和植物激素，能抑制氣孔開放，從而使葉片具有抗蒸騰的作用，進(jìn)而減少植物的水分蒸騰，提高抗逆性[9-10]；PP333是一種高效、低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以抑制細(xì)胞縱向生長(zhǎng)、縮短莖節(jié)、降低株高、改善植物群體結(jié)構(gòu)、提高作物抗寒性、耐旱性和光合活性等[11-12]。6-BA的主要生理效應(yīng)除促進(jìn)細(xì)胞分裂、芽分化、細(xì)胞擴(kuò)大和延緩葉片衰老外[13]，也可提高植物的抗逆性[10]。如0.5 mg·L-1的6-BA誘導(dǎo)香根草能提高香根草的抗寒性，使得香根草能在低溫下生長(zhǎng)良好[14]。BR浸種能增強(qiáng)花生對(duì)低溫的忍耐能力[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過研究姜荷花種球的抗寒生理，明確種球能耐受的低溫閾值，并采用具有抗寒潛力的各種藥劑處理種球，以期找出能提升姜荷花種球抗寒性的方法，為中國姜荷花種球生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心生產(chǎn)的大小一致、無病蟲害及外傷的清邁粉姜荷花種球。取樣時(shí)，從種球的中間位置縱切開，從中切取完整小片(包含外中內(nèi)各層組織，確保取樣代表性)。MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫脅迫處理

目前，生產(chǎn)中姜荷花種球一般在15 ℃左右的環(huán)境越冬，但在中國中部及南部大部分地區(qū)，冬季氣溫一般最低可以達(dá)到-3～-2 ℃(包括浙江省)。本試驗(yàn)以24 ℃為常溫對(duì)照組，以-3 ℃為最低點(diǎn)，每隔4 ℃設(shè)1個(gè)基點(diǎn)，將種球分別置于24、9、5、1、-3 ℃暗處理48 h，然后取出存放于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 藥劑處理

將姜荷花種球用不同藥劑分別浸泡處理24 h，用清水沖洗干凈，再1 ℃低溫脅迫48 h，然后取出存放于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。試?yàn)藥劑包括：1 mg·L-1脫落酸(ABA)、11 mg·L-1或80 μmol·L-1水楊酸(SC)、0.01 mg·L-1油菜素內(nèi)酯(BR)、0.08 mg·L-16-BA、100 mg·L-1多效唑(PP333)，各藥劑濃度設(shè)定參照其他作物相關(guān)研究中最常見的濃度，并作適當(dāng)調(diào)整。另設(shè)對(duì)照組(CK)：清水浸泡24 h后，1 ℃低溫脅迫48 h，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生理生化指標(biāo)檢測(cè)

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定：將種球切塊，用去離子水室溫下浸泡12 h，沸水加熱30 min后再冷卻至室溫。采用電導(dǎo)儀測(cè)定沸水加熱前后的電導(dǎo)率，然后再計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率。

束縛水的測(cè)定采用阿貝折光儀法[17]。用折光儀測(cè)定經(jīng)蔗糖透析前后的濃度，再計(jì)算出束縛水的含量。

MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。所有測(cè)定采用同批次處理種球，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下姜荷花種球的生理生化變化

2.1.1 種球的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA和束縛水含量

如圖1-A所示，姜荷花種球在24 ℃的相對(duì)電導(dǎo)率最低，9 ℃時(shí)電導(dǎo)率顯著升高，說明9 ℃時(shí)種球已處于受低溫脅迫的狀態(tài)；與9 ℃相比，1、5 ℃時(shí)，種球的相對(duì)電導(dǎo)率略有降低，-3 ℃時(shí)，種球的相對(duì)電導(dǎo)率升高，表明-3 ℃時(shí)姜荷花種球細(xì)胞膜的受損最嚴(yán)重。如圖1-B所示，除對(duì)照組外，束縛水含量隨著溫度的降低而逐漸升高，在-3 ℃達(dá)到最高。低溫脅迫處理后，MDA含量明顯增加，在-3 ℃時(shí)達(dá)到最高，表明此時(shí)細(xì)胞膜脂過氧化程度最高，受損最嚴(yán)重(圖1-C)。結(jié)合這3個(gè)指標(biāo)可知，種球在9 ℃已經(jīng)處于逆境脅迫狀態(tài)，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，-3 ℃時(shí)姜荷花種球的受脅迫程度達(dá)到最高。

圖1 低溫脅迫下姜荷花種球的相對(duì)電導(dǎo)率、束縛水含量和MDA含量Fig.1 Relative conductivity， bound water content and MDA content of C. alismatifolia bulbs under low temperature stress

2.1.2 種球的SOD、POD和CAT活性

由圖2-A可知，低溫脅迫時(shí)，姜荷花種球SOD活性沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，與對(duì)照相比，在5、-3 ℃時(shí)，SOD活性顯著增加，9和1 ℃時(shí)SOD活性與對(duì)照相當(dāng)。在9～-3 ℃的低溫脅迫處理過程中，POD活性呈先增加后降低的趨勢(shì)，1 ℃達(dá)到最高，在-3 ℃時(shí)降到最低(圖2-B)。與POD活性類似，在9～-3 ℃的低溫脅迫處理過程中，CAT活性也呈先增加后降低的趨勢(shì)，1 ℃時(shí)CAT活性最高(圖2-C)。由POD和CAT活性變化可知，-3 ℃時(shí)，姜荷花種球已經(jīng)失去抵抗逆境的能力。綜上，9 ℃時(shí)，SOD、POD和CAT活性均沒有表現(xiàn)出明顯的脅迫響應(yīng)，而在5 ℃時(shí)，3個(gè)抗氧化酶的活性都大幅增加，說明溫度降至5 ℃時(shí)，種球已經(jīng)開始啟動(dòng)抗逆響應(yīng)機(jī)制。

圖2 低溫脅迫下姜荷花種球的抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of C. alismatifolia bulbs under low temperature stress

2.1.3 種球的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量

如圖3-A所示，在24～-3 ℃，隨著溫度的降低，脯氨酸含量先增加后降低，5 ℃時(shí)達(dá)到最高，然后逐漸下降，-3 ℃時(shí)達(dá)到最低。與對(duì)照組相比，各處理的可溶性糖含量變化不明顯，1 ℃時(shí)可溶性糖含量最高，-3 ℃時(shí)可溶性糖含量最低(圖3-B)。在9～-3 ℃，隨著溫度的降低，可溶性蛋白含量逐漸增加，1 ℃時(shí)達(dá)到最高，溫度低于1 ℃時(shí)可溶性蛋白含量又下降(圖3-C)。

圖3 低溫脅迫下姜荷花種球細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的變化Fig.3 Changes of osmotic adjustment system of C. alismatifolia bulbs cell under low temperature stress

2.2 藥劑處理對(duì)姜荷花種球抗寒性的影響

2.2.1 不同藥劑處理對(duì)低溫脅迫下種球的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA和束縛水含量的影響

從圖4-A中可以看出，1 ℃處理48 h后，對(duì)照組種球的相對(duì)電導(dǎo)率最高，各藥劑處理組種球的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于對(duì)照，其中，6-BA處理的種球相對(duì)電導(dǎo)率下降幅度最大。如圖4-B所示，1 ℃處理48 h后，與對(duì)照組相比，各藥劑處理組種球的束縛水含量均有不同幅度的增加，其中SC和6-BA處理的增加幅度最大。1 ℃處理48 h后，與對(duì)照組相比，6-BA處理的種球MDA含量顯著增加，ABA處理的種球MDA含量顯著下降，SC、BR和PP333處理的種球MDA含量略有下降，但差異不顯著(圖4-C)。

醫(yī)療體制逐步改革，法律法規(guī)逐漸完善，尊重和保護(hù)病人權(quán)益的呼聲越來越大，導(dǎo)致醫(yī)患矛盾加劇，病人往往不配合床邊教學(xué)。病人周轉(zhuǎn)快、住院天數(shù)縮短等也使得可供選擇的床邊教學(xué)病人減少。

圖4 低溫脅迫下藥劑處理后姜荷花種球的相對(duì)電導(dǎo)率、束縛水含量和MDA含量Fig.4 Effects of different chemicals treatments on relative conductivity， bound water content and MDA content of C. alismatifolia bulbs under low temperature stress

2.2.2 不同藥劑處理對(duì)低溫脅迫下種球SOD、POD和CAT活性的影響

如圖5-A所示，1 ℃處理48 h后，與對(duì)照組相比，各藥劑處理的姜荷花種球SOD活性均顯著增強(qiáng)，其中，6-BA處理的姜荷花種球SOD活性增加幅度最大，其次為BR和PP333處理。除6-BA處理外，各處理的POD活性均較對(duì)照組有顯著增加，SC處理的增加幅度最大，其次是BR、PP333和ABA(圖5-B)。除6-BA處理外，各處理的CAT活性均有顯著增加，ABA和PP333處理的姜荷花種球CAT活性最高(圖5-C)。由此可知，姜荷花種球受低溫脅迫時(shí)，不同藥劑處理的效果不同，如ABA處理可以提高CAT活性，SC處理可以提高POD和CAT活性，BR處理可同時(shí)提高SOD、POD和CAT活性；6-BA處理可以顯著提高姜荷花種球SOD活性，但同時(shí)抑制了POD和CAT活性。

圖5 低溫脅迫下藥劑處理對(duì)姜荷花種球抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of different chemicals treatments on antioxidant enzyme activities of C. alismatifolia bulbs under low temperature stress

為分析各藥劑處理對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的總體效用，將SOD、POD和CAT活性各按1∶1∶1均等權(quán)重累加，將對(duì)照組的總抗氧化酶活性定為1.0，構(gòu)建1個(gè)不同藥劑處理的總抗氧化酶活性圖(圖6)。由圖6可知，與對(duì)照組相比，各處理的總抗氧酶活性均明顯增加，BR、SC、6-BA、PP333和ABA處理組的總抗氧酶活性分別是對(duì)照組的6.2、6.0、5.4、5.2和4.0倍。說明各藥劑處理均能促進(jìn)抗氧化酶的生成，但生成的的抗氧化酶種類各有側(cè)重。

2.2.3 不同藥劑處理對(duì)低溫脅迫下種球脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

1 ℃處理48 h后，除PP333處理外，各藥劑處理的姜荷花種球脯氨酸含量均較對(duì)照組高，其中，ABA和BR處理組脯氨酸含量最高(圖7-A)。與對(duì)照組相比，各藥劑處理的可溶性糖含量均升高，其中ABA處理的可溶性糖含量最高(圖7-B)。如圖7-C所示，除6-BA處理外，其他藥劑處理的可溶性蛋白含量均較對(duì)照高，其中SC處理的蛋白質(zhì)含量最高，其次為BR、ABA處理。

圖6 低溫脅迫下不同藥劑處理對(duì)種姜荷花種球抗總氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of different chemicals on total antioxidant enzyme activity of bulbs under low temperature stress

圖7 低溫脅迫下不同藥劑處理對(duì)種球細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響Fig.7 Effects of different chemicals treatments on cell osmotic regulation of C. alismatifolia bulbs under low temperature stress

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫脅迫下姜荷花種球的生理生化變化

植物受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)最先受到影響[18]，質(zhì)膜透性增大，電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率會(huì)有不同程度的增加。膜透性的大小反映了細(xì)胞膜受損的程度，相對(duì)電導(dǎo)率與膜受傷害程度呈正相關(guān)，電導(dǎo)率越高說明細(xì)胞膜受到的傷害越大[19]。束縛水是指植物體內(nèi)和原生質(zhì)膠體緊密結(jié)合的水分，其含量相對(duì)增加可以增強(qiáng)植物的抗寒能力[20]。MDA含量是膜脂過氧化的指標(biāo)，可以反映植物膜脂過氧化程度及對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱[21-22]。本研究中，9 ℃時(shí)，姜荷花種球的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均顯著增加，說明9 ℃左右時(shí)，姜荷花種球已經(jīng)受到脅迫了。逆境條件下，植物本身具備抵抗逆境的防御系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)是植物常用的2套防御系統(tǒng)?？寡趸赶到y(tǒng)是清除活性氧和自由基的保護(hù)酶系統(tǒng)，可清除脅迫條件下植物體積累的活性氧自由基，降低自由基對(duì)膜系統(tǒng)造成的傷害，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能[23-24]，抗氧化酶包括過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等[17]。滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)是逆境條件下，植物通過滲透調(diào)節(jié)保證一定的膨壓來維持細(xì)胞正常的生理功能[25]。遭受環(huán)境低溫脅迫時(shí)，大多數(shù)植物可在體內(nèi)積累脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖等物質(zhì)[26]，來降低細(xì)胞液的滲透勢(shì)，防止細(xì)胞過度失水，提高植物的抗寒性[27]。由抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)變化可知，5和1 ℃時(shí)，姜荷花種球已經(jīng)調(diào)動(dòng)了自身的抗逆系統(tǒng)來抵御低溫，-3 ℃時(shí)，各抗逆相關(guān)指標(biāo)基本上降低到最低點(diǎn)，表明此時(shí)的低溫已超出種球的耐受極限。

3.2 不同藥劑處理對(duì)姜荷花種球抗寒性的影響

不同藥劑處理對(duì)姜荷花種球抗氧化酶的影響不同，如6-BA處理可顯著提高SOD活性，而POD和CAT活性卻低于對(duì)照。由SOD、POD和CAT的總體活性可知，各藥劑處理均能明顯提高總抗氧化酶活性，其中以BR處理的效果最顯著。

從相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量指標(biāo)來看，1 mg·L-1ABA對(duì)種球的保護(hù)效果最好；0.08 mg·L-16-BA處理雖然對(duì)姜荷花種球膜透性有較好的保護(hù)作用(相對(duì)電導(dǎo)率最低)，但其膜脂氧化程度卻較高(MDA含量最高)；11 mg·L-1SC處理的種球抗寒性較0.01 mg·L-1BR和100 mg·L-1PP333好，BR和PP333處理效果相當(dāng)。由姜荷花種球抗氧化酶系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)可知，ABA主要通過滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)來提高種球抗寒性，抗氧化酶系統(tǒng)的作用沒有其他藥劑處理明顯，這與ABA處理產(chǎn)生的MDA含量低有一定關(guān)系。與此相反，6-BA處理的種球膜脂氧化較嚴(yán)重(MDA含量較高)，總抗氧化酶活性也相當(dāng)高，約是對(duì)照組的5.4倍，但滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)變化不明顯。此外，雖然1 mg·L-1ABA和0.08 mg·L-16-BA對(duì)種球的保護(hù)效果較好，但由于這個(gè)濃度是參照其他植物的研究而確定的，對(duì)姜荷花種球未必是最理想的濃度，因此，后續(xù)試驗(yàn)需要針對(duì)姜荷花種球進(jìn)行濃度篩選，以確保獲得最佳的抗寒效果。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

Physiological and biochemical characteristics ofCurcumaalismatifoliabulbs and effects of some chemicals on its cold resistance

LIU Jianxin， XU Xiaohan，DING Huaqiao

(ResearchandDevelopmentCentreofFlower，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou311202，China)

Curcumaalismatifoliais a new kind of tropical flowers. However， winter in most areas in China is too cold to preserve bulbs naturally. In order to clarify cold-resistance physiology ofCurcumaalismatifoliabulbs， and to find out methods to enhance bulbs cold-resistance， various physiological and biochemical indexes of bulbs which were treated with different low temperature stress were detected， and cold-resistance chemicals screening experiment for bulbs were carried out. The results of physiological and biochemical tests showed thatCurcumaalismatifoliabulbs began to be stressed at 9 ℃. According to changes of antioxidant enzyme system and osmotic adjustment system， these bulbs mobilized their own stress-resistant system to resist adverse effects at 5 and 1 ℃， respectively， While various stress-resistant related indexes reduced to the lowest point at -3 ℃， which might be beyond the tolerance limit of bulbs. The cold-resistant chemicals screening experiment showed that all chemicals treatments including abscisic acid， salicylic acid， brassinolide， 6-BA， paclobutrazol could enhance cold tolerance of bulbs. According to cell damage degree analysis， 1 mg·L-1ABA immerged bulbs for 24 h had the best protective effect to bulbs. 0.08 mg·L-16-BA treatment also could protect membrane permeability， but the oxidation degree of membrane lipid was very high.

Curcumaalismatifolia; Chiang Mai Pink; bulb; cold resistance; abscisic acid

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.09

2016-11-03

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目(重大課題主持能力培養(yǎng)類)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技發(fā)展專項(xiàng)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技產(chǎn)業(yè)化資金項(xiàng)目；杭州市科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目(20163501Y78)

劉建新(1980—)，男，湖南祁陽人，助理研究員，博士，主要從事花卉育種和栽培研究。E-mail: liujianxin2000@aliyun.com

S682.2+9

A

1004-1524(2017)04-0575-08

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 575-582

劉建新， 徐笑寒， 丁華僑. 姜荷花種球抗寒生理生化特征及促抗寒藥劑效果[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 29(4): 575-582.