馮華+石尚友+羅秀瓊+王世俊+鄭凰雅+王祥培

【摘要】目的：對(duì)黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸進(jìn)行定性與定量分析。方法：采用TLC色譜法，以綠原酸為對(duì)照，建立定性鑒別方法；采用HPLC色譜法，建立其含量測(cè)定方法。結(jié)果：TLC法能很好分離各成分；高效液相色譜法綠原酸在00102～01142mg范圍內(nèi)與峰面積響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（r=09998），平均加樣回收率為 990%。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)大菟絲子質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可用于大菟絲子藥材的有效鑒別。

【關(guān)鍵詞】黔產(chǎn)大菟絲子；綠原酸；定性與定量

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）05-0014-03

大菟絲子為旋花科植物大菟絲子（Cuscuta Japonica Choisy）的干燥成熟種子，收載于2003版貴州省《中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]。本品為少數(shù)民族藥材，性辛、甘、平，具有滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉功效，臨床用于腎虛腰痛、陽(yáng)痿遺精、目昏耳鳴、胎動(dòng)不安、尿頻等。大菟絲子藥材中含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩岬扔袡C(jī)酸類(lèi)成分[3]，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，目前尚無(wú)對(duì)大菟絲子中綠原酸薄層鑒別和HPLC法含量測(cè)定方法的報(bào)道，筆者對(duì)大菟絲子中綠原酸薄層和含量測(cè)定進(jìn)行研究，建立了綠原酸的薄層鑒別與含量測(cè)定方法，為大菟絲子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和控制提供參考。

1儀器與材料

11儀器Agilent LC-1260高效液相色譜議（包括四元泵，DAD，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站）；AB204-S型梅特勒電子天平；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

12材料綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-20314，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。聚酰胺薄膜（購(gòu)于青島海洋化工有限公司），乙睛為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。

大菟絲子采集于貴州省各地區(qū)，經(jīng)遵義市食品藥品檢驗(yàn)所鄧順超副主任中藥師鑒定為旋花科植物大菟絲子的干燥成熟種子，樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

21薄層鑒別[1]取本品粉末約10g，置具塞量瓶中，加甲醇10mL，超聲30min，濾過(guò)，濾液水浴上濃縮約1mL，作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇溶液制成每1mL含01mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2015年版四部附錄）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果表明，分離度好，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

22綠原酸的含量測(cè)定[3]

221色譜條件[2-3]色譜柱：Eclipse XDB-C18（5μm，46mm×250mm）；流動(dòng)相：乙睛-01%磷酸溶液（12∶88），流速為：10mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm。進(jìn)樣量10μL，分離度為24，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)，應(yīng)不低于3500，色譜圖見(jiàn)圖2、圖3。

222對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品1060mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，精密吸取2mL置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

223供試品溶液制備精密稱(chēng)取大菟絲子藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）約10g，置具塞瓶中，加甲醇25mL，稱(chēng)定重量，超聲50min，放置至室溫，用甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

224檢測(cè)波長(zhǎng)確定照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在200～400nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，綠原酸和樣品在325nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm。

225線性關(guān)系的考察分別配制6個(gè)不同濃度綠原酸對(duì)照品溶液，濃度分別為00102、00204、00408、00816、00979、01142mg/mL，進(jìn)樣量為10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以綠原酸濃度（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算綠原酸回歸方程為：Y=68654X+00560（r=09998）。結(jié)果表明，在00102～01142mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

226精密度試驗(yàn)精密吸對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定6份，平均峰面積657836，RSD=04%，表明儀器精密度良好。

227穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批藥材粉末約10g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀中，分別在0、2、4、8、12h測(cè)定一次，平均峰面積為682360，RSD為08%，表面供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

228重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材粉末約10g6份，精密稱(chēng)定，照“223”項(xiàng)下制備方法制備成供試品溶液。進(jìn)樣10μL，平均含量為012%，RSD為11%，表明重復(fù)性良好。

229加樣回收試驗(yàn)稱(chēng)取已測(cè)定S1號(hào)樣品粉末5份（含量為012%），每份約05g，精密稱(chēng)定，加入綠原酸對(duì)照品濃度為030mg/mL溶液2mL，按“223”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“221”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算綠原酸平均回收率為990%，RSD為06%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2210含量測(cè)定分別測(cè)定大菟絲子藥材不同產(chǎn)地樣品，測(cè)定其含量，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3，圖譜見(jiàn)圖4。

3討論

31綠原酸的TLC鑒別采用乙醇、甲醇溶劑提取后，乙醇提取溶液的斑點(diǎn)分離效果不佳，甲醇提取的各斑點(diǎn)能有效分離。按正文方法操作，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。置紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果表明，分離度好，斑點(diǎn)顯色清晰。以甲醇-冰醋酸-水不同比例為展開(kāi)劑，在聚酰胺薄膜上展開(kāi)，經(jīng)過(guò)不同比例調(diào)整。以甲醇—冰醋酸-水（4∶1∶5）溶液為展開(kāi)劑，在聚酰胺薄膜上展開(kāi)，斑點(diǎn)清晰，分離完全，。所以選擇聚酰胺薄膜板，甲醇—冰醋酸-水（4∶1∶5）溶液為展開(kāi)劑。

32綠原酸提取條件的優(yōu)選選用甲醇、80%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，超聲、回流提取時(shí)間為40、50、60min?；亓髋c超聲提取綠原酸含量沒(méi)有差異，選擇甲醇25mL超聲50min，藥材中綠原酸提取完全，選用甲醇為溶劑比較好；對(duì)色譜條件進(jìn)行選擇，以乙睛-01%磷酸溶液（12∶88），流速為10mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，各組分峰達(dá)到完全分離。

綜上，本法簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確度高，可用于大菟絲子的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

[2]貴州省食品藥品監(jiān)督管理局編.《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[S].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：39.

[3]瞿燕，李瓊， 魏文龍，等.大菟絲子生品和鹽炙品HPLC-UV特征圖譜及7個(gè)有機(jī)酸含量變化研究[J].藥物分析，2014，34（5）：824-829.