王正想,馮世軍,張廣靜,張國強(qiáng) ,劉思源

1．河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科(滄州061001)，2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科(石家莊050010)， 3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科(石家莊050010)

·基礎(chǔ)研究·

RNA干擾CXCR4基因?qū)θ藧盒院谒亓鯝375增殖和凋亡的影響*

王正想1,馮世軍1,張廣靜1,張國強(qiáng)2,劉思源3△

1．河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科(滄州061001)，2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科(石家莊050010)， 3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科(石家莊050010)

目的：觀察CXCR4基因沉默后人惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖及侵襲能力變化。方法：體外培養(yǎng)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞，分為A、B、C 3組，分別為siRNA組，轉(zhuǎn)染空病毒載體的陰性對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理的空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后1、3、5、7 d在倒置相差顯微鏡觀察A375細(xì)胞分化及形態(tài)，MTT比色分析法檢測(cè)對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制的影響，采用流式細(xì)胞分析術(shù)，Anexin-ⅴ-PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的變化。轉(zhuǎn)染后7d采用RT-PCR檢測(cè)CXCR4 siRNA表達(dá)情況。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后C組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂，漂浮細(xì)胞增多。轉(zhuǎn)染后1、3、5、7 d，A組OD值低于B、C組(P<0.05)，A組早期凋亡率的變化與B、C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，A、B、C組CXCR4基因 mRNA校正值分別為(0.149±0.043)，(0.215±0.030)，(0.221±0.020)，A 組與B、C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：CXCR4基因沉默后A375細(xì)胞增殖被抑制，早期凋亡增加，CXCR4基因成為惡性黑素瘤治療的新靶點(diǎn)。

惡性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是起源于神經(jīng)嵴的黑素細(xì)胞惡性腫瘤，發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的第三位[1-2](6.8%～20%)，是皮膚科領(lǐng)域最常引起死亡的惡性腫瘤,其病死率占全部皮膚腫瘤的65%[3]，且發(fā)病人數(shù)逐漸增多[4]，惡性黑色素瘤的惡性程度高﹑發(fā)生轉(zhuǎn)移早,對(duì)放/化療均不敏感 ，目前轉(zhuǎn)移性黑素瘤的預(yù)后差，平均生存時(shí)間為6～9個(gè)月。近年來，認(rèn)識(shí)到MM是一種異質(zhì)性疾病，其形成與一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常相關(guān)，其中主要包括CKIT途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、P13K-AKT等途徑中的多個(gè)基因，MM的分子靶向治療成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。一些研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體4(Chemokin receptor 4,CXCR4)在包括黑素瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor，SDF-1)與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸在多種腫瘤播散、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究通過RNAi的方法沉默趨化因子受體4(Chemokin receptor 4,CXCR4)基因，抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路中趨化因子受體4的表達(dá)對(duì)黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，從而在細(xì)胞水平抑制惡性黑色素瘤的生長增殖，為MM治療提供新的方法。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與材料 人黑色素瘤細(xì)胞株A375由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，胎牛血清購自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMEM(高糖型)培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司，腺病毒載體武漢晶賽生物公司合成，CO2恒溫培養(yǎng)箱(TC2323)購自美國Sheldon公司， RT-PCR酶混合物試劑盒(美國Fermentas公司)、二甲基亞楓(DMSO)北京化工廠。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 A375細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含濃度為100 μ/ml青霉素、鏈霉素，pH7.2～7.4)，置于37℃﹑5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，3次傳代穩(wěn)定后用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為A、B、C 組。

3 CXCR4基因合成與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)4～6 h待細(xì)胞完全貼壁，小心吸出各孔培養(yǎng)液。各組均加入不含牛血清的培養(yǎng)基100 μl，A、B分別加入DMEM培養(yǎng)基/CXCR4 siRNA病毒載體復(fù)合體、DMEM培養(yǎng)基/病毒載體，C 組不做任何處理，感染時(shí)間為90 min，每15 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)液一次，以混勻。 90 min后移除含病毒的無血清培養(yǎng)液，加入含血清的常規(guī)培養(yǎng)液，放入37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5、7d時(shí)熒光顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)染效率(英光顯微鏡下細(xì)胞個(gè)數(shù)/光學(xué)微鏡下細(xì)胞個(gè)數(shù))，觀察細(xì)胞分化及形態(tài)學(xué)變化，消化回收細(xì)胞備用。

4 RT-PCR檢測(cè)三組CXCR4基因mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)1 d后，按TRIzol 試劑盒說明書步驟抽提A、B組和C組細(xì)胞的總RNA并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過RT-PCR生成cDNA，以cDNA作為模板，采用Real-time PCR檢測(cè)CXCR4 mRNA，RT-PCR引物設(shè)計(jì): 引物由上海捷瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成和PAGE純化，用無菌去離子水稀釋，引物序下：上游序列 5-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3，下游序列 5-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3。瓊脂糖凝膠電泳: 分別取5ulRT-PCR產(chǎn)物、Marker，在1.5%的瓊脂糖凝膠中，恒壓80V電泳30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行分析。

5 MTT比色法檢測(cè)沉默CRCX4基因后A375細(xì)胞的增殖影響情況 取對(duì)數(shù)生長期的A375細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至1×104個(gè)細(xì)胞/200μl，分別接種到5個(gè)不同的96孔板中，每組接種6個(gè)復(fù)孔細(xì)胞培養(yǎng)過夜，按上述分組及轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后蓋好蓋子，周邊貼膠布，在其上標(biāo)明日期。放入37℃﹑5% CO2的培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7天相同時(shí)相點(diǎn)時(shí)前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃﹑5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后棄上清液，每孔加入DMSO150 μl，避光條件下震蕩10～15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長492nm處測(cè)定各孔光吸收值，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

6 AnnexinⅤ與PI雙染，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)相的早期凋亡情況 取生長狀態(tài)良好的瓶裝細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/瓶，分到60不同個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)分為A組、B組、C組，各組組又隨機(jī)分為1 d，3 d，5 d，7 d組，相當(dāng)于1 d，3 d，5 d，7 d組每組5個(gè)標(biāo)本，分組后按上述轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，后繼續(xù)培養(yǎng)一天，收集1 d組細(xì)胞，PBS洗滌后250 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入5 μlAnnexinⅤ/FITC，室溫下孵育避光15 min，加入10 μl的碘化柄錠(PI)溶液，再避光孵育15 min培養(yǎng)瓶，洗去多余抗體和PI,流式細(xì)胞儀(FACS)分析，APOI(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù))表示細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d重復(fù)以上操作。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)全部以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置相差顯微鏡觀察各組人黑色素瘤細(xì)胞A375形態(tài) B、C組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，有很強(qiáng)的貼壁能力，細(xì)胞膜完整光滑，呈單細(xì)胞層片狀生長。A組細(xì)貼壁能力差，有少數(shù)圓形細(xì)胞，部分細(xì)胞皺縮破裂，折光性差，較多懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞數(shù)量較B、C組減少,見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài) (HE染色×400)

2 轉(zhuǎn)染CRCX4基因?qū)θ藧盒院谏亓黾?xì)胞A375增殖抑制的影響 轉(zhuǎn)染CRCX4基因后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制情況，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后1、3、5、7 d， A組吸光光度值低于B、C組, A組與C組有顯著性差異(P<0.05),而B組與C組之間無顯著性差異(P>0.05),見表1。

表1 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間OD值比較(±s)

注:A組與 C、B組相比,P<0.05

3 轉(zhuǎn)染CRCX4基因后對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375早期凋亡的影響 AnnexinⅤ-PI雙染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4基因后1、3、5、7 d， A組凋亡率吸光光度值高于于B、C組, A組與C組、B組有顯著性差異(P<0.05),而C組與B組之間無顯著性差異(P>0.05)。

4 RT-PCR方法檢測(cè)各組基因mRNA的表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示：經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后7 d A、B、C組均在300bp處出現(xiàn)電泳條帶，但A組CRCX4基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。RT-PCR半定量分析結(jié)果顯示，A組人黑色素瘤A375細(xì)胞CRCX4基因 mRNA校正值為(0.149±0.043)，較B組(0.221±0.020)、C組(0.215±0.030)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

隨著人們對(duì)惡性黑色素瘤分子生物學(xué)異常的逐步認(rèn)識(shí)，分子靶向治療成為國內(nèi)外腫瘤治療中的熱點(diǎn)，開辟了惡性黑色素瘤的新的治療途徑，是該病治療新的發(fā)展方向。

RNA干擾技術(shù)是人們研究基因調(diào)控的一種新的手段，F(xiàn)ire等在進(jìn)行線蟲基因沉默的研究中將這種雙鏈RNA(ds-RNA)抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAi)。后來，大量科研人員一直致力于該項(xiàng)技術(shù)的改進(jìn)與完善，現(xiàn)在在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已成為相對(duì)比較成熟的調(diào)控基因的手段，RNA干擾所采用的載體主要有多聚復(fù)合物、納米顆粒載體、病毒和細(xì)菌載體等，病毒載體又可分為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、和慢病毒[5]等。

目前研究報(bào)道[6]中與惡性黑色素瘤分子靶向治療有關(guān)的基因有Raf基因、Ras基因、c-Kit基因、nm23基因[7]等，CXCR4是最常見的趨化因子受體，表達(dá)包括卵巢癌，黑素瘤和前列腺癌等腫瘤，但在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)水平很低，越來越多的研究表明，趨化因子受體CXCR4與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)有關(guān)，Kim等研究報(bào)道，CXCR4在人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其CXCR4高表達(dá)則預(yù)后差，然而，CXCR4在黑色素瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中具體機(jī)制研究尚不多，CXCR-4 通過各種信號(hào)通路調(diào)控人體的各項(xiàng)機(jī)能，而且各種信號(hào)通路間存在著緊密的聯(lián)系，有研究證實(shí)CXCR-4可以通過調(diào)控 ERK 及PI3K/AKT信號(hào)通路影響細(xì)胞周期及細(xì)胞的增殖 ，因此CXCR4趨化因子可能作為CXCL12的受體通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮促子黑素瘤細(xì)胞增殖和凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒相關(guān)載體沉默CXCR4基因結(jié)果表明A375細(xì)胞的增殖受到抑制，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率增加，沉默CXCR4基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前尚未完全明確。但沉默CXCR4基因后可能通過ERK及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，在瘤細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。沉默CXCR4基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是CXCR4細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，能夠使MEK1/2和ERK磷酸化，從而阻斷MAPK通路，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375的早期凋亡。

[1] 饒國洲，石建峰，王欣欣.Survivin 和 Bcl-2基因靶向 siRNA 對(duì)舌癌 Tca-8113細(xì)胞生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(2):140-143.

[2] 王玲艷,晉紅中.2014年皮膚惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華皮膚科雜志,2015,(48)11:822-825.

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(收稿：2016-05-15)

Effection of A375 cells in proliferation and apoptosis after silencing CXCR4 gene

Wang Zhengxiang ,Feng Shijun ,Zhang Guangjing,et al.

Institute of Dermatology,The Center Hospital of Cangzhou(Cangzhou 061001)

Objective：To explore the proliferation and apoptosis of A375 cells after silencing CXCR4 gene. Methods:Human malignant melanoma A375 cells were cultivated and divided into groups A,B and C：siRNA group with adenovirus carrying RNA interference,negative group with vacant adenovirous vector,and control group without any infection.The differentiation and morphology of cells were observed by inverted microscope. 1, 3, 5, 7days after transfection,cells proliferation ability was determined by MTT,and apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI.The expressions of CXCR4 mRNA was detected by RT-PCR 7 days after transfection. Results:The cells proliferation ability of group A at 1, 3, 5 and 7days after transfection was lower than those in groups B and C(P<0.005).The expression of CXCR4 siRNA decreased in the A group than groups B and C .CXCR4 gene silenced by siRNA could inhibit the growth of A375 cell proliferation(P<0.05)and induce early cells apoptosis(P<0.05).Conclusion:The cells proliferation ability of A375 is inhibited and apoptosis is induced after silencing CXCR4 gene.

Melanoma Adenoviruses, Human @A375cell @CXCR4 Apoptosis

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30440086)

黑色素瘤 腺病毒, 人 @A375細(xì)胞 @CXCR4 細(xì)胞凋亡

R739.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.04.001

△通訊作者