袁寶東

(遼寧省北鎮(zhèn)市五峰林場(chǎng)，遼寧 錦州 121315)

平榛花粉活力測(cè)定方法比較

袁寶東

(遼寧省北鎮(zhèn)市五峰林場(chǎng)，遼寧 錦州 121315)

采用TCC染色法、I2-KI染色法和固體培養(yǎng)基萌發(fā)法等3種常見(jiàn)的花粉活力測(cè)定方法對(duì)新采集的平榛花粉進(jìn)行活力測(cè)定，結(jié)果表明：采用TCC染色法和I2-KI染色法染色后花粉的辨識(shí)度低，影響對(duì)花粉活力的判斷；固體培養(yǎng)基萌發(fā)法辨識(shí)度高，萌發(fā)率高，適合作為平榛花粉活力測(cè)定方法。

平榛；花粉活力；萌發(fā)率；染色法

平榛(CorylusheterophyllaFisch.)是我國(guó)東北地區(qū)重要的野生資源，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在黑龍江、吉林和遼寧山區(qū)廣泛分布[1]。由于其果實(shí)豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不論是鮮果還是加工產(chǎn)品均深受人們喜愛(ài)[2]。隨著研究的深入，平榛不僅形成了自身的栽培管理模式，還由于其抗寒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被用作育種親本。不管在栽培中配置授粉樹(shù)還是作為父本用于雜交育種，都需要明確種質(zhì)資源的花粉萌發(fā)能力。目前關(guān)于平榛花粉活力的測(cè)定方法尚未開(kāi)展系統(tǒng)研究。鑒于此，筆者參照杜鵑[3]、玉米[4]、木薯[5]、韭菜[6]等植物花粉活力測(cè)定方法對(duì)平榛花粉活力測(cè)定方法進(jìn)行比較，旨在為建立快速有效的平榛花粉活力測(cè)定方法，為人工授粉育種和授粉樹(shù)配置提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年3月在遼寧省鐵嶺市黃金溝地區(qū)，采集待開(kāi)放的雄花花序的健壯枝條。采集后送往實(shí)驗(yàn)室陰涼處水培1 d后收集新鮮花粉。待花藥散出花粉粒后，收集花粉粒于5 mL試管內(nèi)并用錫箔紙包裹保存在-20 ℃環(huán)境下以備實(shí)驗(yàn)，使用時(shí)取出室溫放置1 h。

1.2 試劑和儀器

碘(I2)、碘化鉀(KI)、氯化三苯基四氮唑(TCC)、蔗糖、瓊脂糖等試劑及耗材，購(gòu)自上海生物工程有限公司。培養(yǎng)箱為上海精密儀器儀表有限公司生產(chǎn)的LHS-100CH。

1.3 試驗(yàn)方法

TCC染色法：在載玻片上涂勻花粉后加1滴TTC溶液并蓋上蓋玻片。將樣品放置于20 ℃培養(yǎng)箱，10 min后取出進(jìn)行顯微觀察。凡染為紅色的活力強(qiáng)，淡紅的次之，無(wú)色者為無(wú)活力花粉或不育花粉。

I2-KI染色法：將少量花粉均勻置于載玻片后加1滴I2-KI溶液，2 min后取出顯微觀察。凡染成藍(lán)紫色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉,呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。

固體培養(yǎng)基萌發(fā)法：培養(yǎng)基的配制參照胡適宜的方法[7]。培養(yǎng)基設(shè)置如下：0.7%瓊脂，4個(gè)蔗糖濃度水平(5%、10%、15%和20%)，3個(gè)硼酸濃度水平(0.010 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1)。培養(yǎng)基熔解后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。冷卻后，用牙簽蘸取少量花粉均勻彈在培養(yǎng)基上，帶花粉的培養(yǎng)基放置于20 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下測(cè)定萌發(fā)率，萌發(fā)的花粉數(shù)總數(shù)與觀察的花粉總數(shù)比值即為花粉萌發(fā)率。

以上3種方法均在4倍顯微鏡下，隨機(jī)選取5～10個(gè)花粉數(shù)大于20的視野，要求觀察花粉總數(shù)大于200。每種方法重復(fù)3次，每次檢測(cè)花粉數(shù)量200個(gè)以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基條件對(duì)平榛花粉萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)中，選用4水平蔗糖濃度及3水平硼酸濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)平榛花粉并測(cè)定其萌發(fā)率，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，同水平硼酸濃度下，當(dāng)蔗糖濃度在5%～15%區(qū)間內(nèi)，花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而逐漸升高；當(dāng)蔗糖濃度超過(guò)15%時(shí)，萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而降低。15%時(shí)花粉萌發(fā)率均為最高值，萌發(fā)率分別為84.3%、73.9%和82.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同水平蔗糖濃度下，硼酸濃度對(duì)平榛花粉萌發(fā)作用規(guī)律不明顯。15%蔗糖濃度條件下，最佳硼酸濃度為0.01 mg·mL-1，此時(shí)花粉萌發(fā)率最高，達(dá)到84.3%。

圖1 不同蔗糖、硼酸濃度對(duì)平榛花粉萌發(fā)率的影響

2.2 不同方法測(cè)定平榛花粉生活力的比較

采用TTC染色法，花粉均呈淡紅色，顏色的深淺差異不顯著，對(duì)花粉?；盍顩r辨識(shí)困難。采用I2-KI染色法，花粉呈藍(lán)色，顏色的深淺差異同樣不顯著，辨識(shí)度差。此外，從表1可知，采用染色法的測(cè)定結(jié)果均低于固體培養(yǎng)基萌發(fā)法。固體培養(yǎng)基萌發(fā)法與以上2種染色方法相比，花粉萌發(fā)率測(cè)定值最高，且不必通過(guò)花粉的顏色辨識(shí)花粉活力情況，判斷方法客觀、準(zhǔn)確。因此，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC法和I2-KI法更適用于平榛花粉活力的測(cè)定。

表1 不同方法對(duì)平榛花粉生活力的測(cè)定比較

3 結(jié)論與討論

比較3種測(cè)定平榛花粉生活力方法發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC染色法和I2-KI染色法更易掌握，結(jié)果準(zhǔn)確性更高，更適合作為平榛花粉活力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。2種染色法測(cè)定花粉的生活力雖然具有步驟簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但測(cè)定結(jié)果低于固體培養(yǎng)基的測(cè)定方法，這可能與花粉壁厚度有關(guān)，增加了測(cè)定的誤差。

在比較蔗糖和硼酸濃度對(duì)平榛花粉生活力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：一定范圍內(nèi)，隨蔗糖濃度的提高花粉萌發(fā)率也增加，超過(guò)此范圍就則相反。這是因?yàn)檎崽遣粌H為花粉管的萌發(fā)提供能量，同時(shí)還參與細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。當(dāng)蔗糖濃度在未打破滲透壓平衡時(shí)，隨著濃度的增加花粉營(yíng)養(yǎng)供給越充分，花粉萌發(fā)率越高；當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到并超過(guò)一定值后會(huì)打破這種平衡，使細(xì)胞脫水而抑制花粉萌發(fā)。硼元素對(duì)于花粉也很重要，這是因?yàn)榕鸬娜狈?huì)導(dǎo)致花粉粒中脫氫酶活性降低而使呼吸作用受到抑制，最終影響花粉萌發(fā)。本研究未發(fā)現(xiàn)硼酸濃度對(duì)平榛花粉萌發(fā)的作用規(guī)律性，這可能因?yàn)橐欢ㄕ崽菨舛葪l件下花粉對(duì)硼元素的需求存在差異。

[1] 梁維堅(jiān),董德芬.大果榛子育種與栽培[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2002

[2] 姜殿勤,王素玲,張儉衛(wèi).野生平棒綜合開(kāi)發(fā)利用初探[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2005(10):19-20

[3] 張超儀,耿興敏.六種杜鵑花屬植物花粉活力測(cè)定方法的比較研究[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2012,30(1):92-99

[4] 王燕哲,崔彥宏,張麗華,等,玉米花粉活力測(cè)定方法的比較研究[J].玉米科學(xué),2010,18(3):173-176

[5] 俞奔馳,李軍,盤(pán)歡,等.木薯花粉活力測(cè)定及驗(yàn)證試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(13):25-27

[6] 汪妮,張志軒,董自梅.韭菜花粉生活力測(cè)定方法的篩選研究[J].長(zhǎng)江蔬菜,2009,(2):53-54

[7] 胡適宜.花粉生活力的測(cè)定[J].植物學(xué)通報(bào),1993,70(2):60-62

Comparison of Determination Methods of Pollen Viability ofCorylusheterophylla

Yuan Baodong

(Wufeng Forest Farm,Beizhen City,Liaoning Province,Jinzhou 121315,China)

The activity of fresh pollen was measured by adopting TCC staining,I2-KI staining & solid medium germination method.Result shows that the identifiability is low after adopting TCC staining,I2-KI staining,which affect the judgement of pollen vigor;adopting solid medium method can obtain high identifiability,which can be determination method for pollen vigor ofCorylusheterophylla.

Corylusheterophylla; pollen vitality; germination rate; staining method

1005-5215(2017)03-0024-02

2017-01-03

袁寶東(1968-),男，遼寧錦州人，大學(xué)，工程師，現(xiàn)從事林業(yè)資源保護(hù)工作.

Q944.42

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.03.009