王志國/遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預防控制中心

禽流感病毒（H9亞型）LN株的分離鑒定及生物學特性研究

王志國/遼寧省北鎮(zhèn)市動物疫病預防控制中心

禽流行性感冒(簡稱禽流感，Avain Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類(包括家禽和野禽)的感染疾病綜合征，主要引起禽類的全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織確立為A類傳染病。根據禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發(fā)病率高，但死亡率低。

2010年，筆者于遼寧某市某養(yǎng)殖場的發(fā)病雞群中分離到一株禽流感病毒，經鑒定為H9N2亞型禽流感，命名為LN株，其具有經胰酶處理后能在細胞上增殖的特性。為了評價MDCK細胞高適應的禽流感疫苗株LN的生物學特性和免疫效果，我們進行了一系列的試驗研究。

一、試驗方法

（一）病毒的分離

2010年，從遼寧省某養(yǎng)雞地區(qū)的疑似H9N2禽流感發(fā)病雞群中，無菌采取具有典型臨床癥狀病雞的肺臟和肝臟等剪碎，按1∶5（W/V）加入滅菌生理鹽水后，研缽研磨后-40℃到室溫凍融3次，經3 000 r/min離心15 min取上清液備用。

將上述病料上清液通過0.22μm微孔濾器除菌，尿囊腔接種10日齡非免疫雞胚。每份病料接種8枚雞胚，每枚雞胚接種0.2 ml，同時作不接種對照，37℃孵育。棄去24 h內死胚，無菌收集48 h的雞胚尿囊液，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病毒分離后需要在SPF雞胚上進行3次終點有限稀釋克隆純化，即每一次均取最高稀釋度有血凝價雞胚尿囊液作為下一次傳代純化的種毒，如此經三次純化后，以10-3稀釋接種9～11日齡SPF胚，48小時后收取雞胚尿囊液，經菌檢證明無污染，分裝于小管中作為種毒貯存于-70℃。

（二）血清學及RT-PCR鑒定

將無菌收集的雞胚尿囊液以1.0%雞紅細胞懸液采用β微量法進行HA試驗，以HA價≥3 log2為試驗陽性。對有直接血凝性的樣本進行H9亞型AIV HI（血凝抑制試驗）與NI（神經氨酸酶抑制試驗）。

根據GenBank已發(fā)表的H9N2毒株的HA基因序列，用Primer 5.0軟件設計了一對H9N2 HA基因的特異性引物，用于HA基因部分序列的擴增。預期擴增產物片段長度為753 bp。引物的序列如下：上游引物(18個堿基)：5′-AATGGTCCTACATCGTCG-3′；下游引物(18個堿基)：5′-TGGCTCCAAATAGTCCTC-3′，以上引物由上海生物工程有限公司合成。

（三）分離毒在MDCK細胞中的增殖

將純化的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種90%長成單層后的MDCK細胞，37℃培養(yǎng)48～72 h，病變達75%以上放入-70℃中反復凍融3次，收獲病毒液。傳代10次，直至病毒在MDCK細胞增值良好。

（四）分離病毒LN株致病性的測定

通過雞胚半數感染量(EID50)、半數組織感染量(TCID50)和靜脈接種指數(IVPI)試驗來檢測分離病毒LN株的致病性，試驗中對細胞毒和胚毒進行了同步試驗，以比較不同培養(yǎng)方式繁殖的病毒液在毒力方面的差異，試驗方法如下。

1.病毒EID50測定。

將分離病毒用滅菌生理鹽水作10-1～10-9稀釋，并設立空白對照組，每個稀釋度接種5枚10日齡非免疫雞胚，棄24 h死亡胚，于接種后72 h 4℃過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊液，測定其HA效價，并參考Reed-Muench方法計算出病毒EID50。

根據EID50結果，將LN株以l×107EID50劑量接種0.lml/胚，35℃溫箱孵育，詳細記錄雞胚死亡情況，以評定分離病毒LN株對雞胚的致病性。

2.病毒TCID50測定。

（1）將狀態(tài)良好的MDCK細胞以2～3×105個/孔接種96孔細胞培養(yǎng)板，置37 C，6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h。

（2）用超純水配制的無菌PBS(pH7.2)將病毒液進行10倍梯度稀釋，設置10-3～10-108個稀釋梯度。

（3）棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌已培養(yǎng)成單層的MDCK細胞三遍，以去除培養(yǎng)基中的血清成分，避免血清對病毒吸附的影響。

（4）將每個稀釋度的病毒接種于MDCK細胞，每個稀釋度接種8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。

（5）棄去吸附液，用滅菌PBS洗滌MDCK細胞一遍，加入含終濃度2μg/ml的TPCK-trypsin的細胞維持液(無抗無血清的DMEM培養(yǎng)基置35℃，6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次。

（6）待到細胞病變(CPE)和HA效價不再發(fā)生變化時，用Reed-Muench公式計算TCID50。

3.靜脈接種致病指數(IVPI)的測定。取6周齡非免疫雞8只，按中華人民共和國獸用生物制品質量標準的方法測定IVPI。引起禽流感的A型流感病毒對6周齡雞的靜脈致病指數(IVPI)大于1.2或感染的A型流感病毒H5或H7亞型的核苷酸序列在血凝素的裂解位點上有多個堿性氨基酸，即確定為高致病性禽流感病毒。

（五）禽流感H9N2亞型LN株免疫保護試驗

為了排除免疫抗原量對免疫效果的影響，根據試驗中測得的數據，通過用空白尿囊液稀釋的方法，將經MDCK細胞和雞胚擴增的兩種病毒液調整為具有相同HA效價、EID50和TCID50的三組病毒液，并分別制備成油乳劑滅活苗，各組免疫相同的劑量后，觀察免疫及保護效果。

1.實驗動物分組。

NC/NE—表示未經稀釋的原始細胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

HC/HE—表示經稀釋得到的具有相同HA效價的細胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

EC/EE—表示經稀釋得到的具有相同EID50的細胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

TC/TE—表示經稀釋得到的具有相同TCID50的細胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

每組14只SPF雞，同時留5只不免疫作為攻毒對照組。

2.免疫及攻毒。所有試驗SPF雞于負壓隔離器內飼養(yǎng)至4周齡進行免疫，免疫前采血，HI抗體檢測均為陰性。滅活疫苗按每只0.3 ml的劑量經胸部肌肉接種免疫。首免后第7、14、21天采血，用商品化標準抗原檢測抗體效價。免疫后4周4周后，用分離病毒LN株尿囊液做攻毒試驗。攻毒劑量均為105.0EID50，每只雞100μL。毒后的第3，5，7天分別采取咽喉和泄殖腔拭子，進行病毒分離檢測，取處理后的樣本上清以尿囊腔途徑接種SPF雞胚，收集死亡雞胚的尿囊液進行HA效價檢測，當HA效價達4 1og2以上時，確定病毒分離為陽性。

二、結果

（一）病毒分離

病料經過4代雞胚培養(yǎng)后，HA血凝價逐漸穩(wěn)定，雞胚死亡數開始增長，胚體病變逐漸明顯。種毒經適當稀釋后，接種SPF雞胚尿囊腔，收集接種后48～72 h雞胚的尿囊液，經離心純化后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）HI及NI試驗結果

取病毒分離為陽性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清進行HI試驗，不產生抑制現象，表明分離株并非上述病毒株，結果只能被H9 AIV陽性血清所抑制。神經氨酸酶抑制試驗檢測，該病毒只能被N2亞型陽性血清特異性抑制，因此，鑒定結果為H9N2亞型禽流感病毒，并命名為A/Chicken/Jilin/LN（縮寫為LN）。

用H9N2 AIV HA基因的特異性引物對該毒株的雞胚尿囊液進行RT-PCR擴增，也得到753 bp的目的基因片段(圖1)，與預期結果相符。

圖1 吉林市分離株HA基因的RT-PCR擴增結果

（三）分離病毒LN的致病性測定

分離病毒LN株接種10只10日齡SPF雞胚后，24 h內無雞胚死亡。在36～96 h孵育期間致死4枚雞胚，死亡率40%。

表1 分離病毒LN株致病性測定

（四）禽流感H9N2亞型LN株免疫保護試驗

在本試驗中，我們將分離病毒LN株油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，并排除了免疫時抗原量對各組免疫保護效果的影響，在免疫后1周雞群就可檢測到低水平的HI抗體水平，免疫后2周免疫組所有雞群都產生明顯的抗體，平均HI抗體水平達6 1og2，免疫后3周各試驗組的HI抗體水平達到高峰，平均效價達7 1og2以上（見表2），表明分離病毒LN株作為疫苗株具有良好的免疫原性，免疫動物以后能產生較高的抗體水平，且從抗體檢測結果可以看出在各個時間點細胞上清免疫組的抗體水平均要比尿囊液免疫組高，抗體水平上升也較快。

表2 不同試驗組在免疫后不同時間的抗體水平

三、結論

成功從遼寧省發(fā)病雞中分離到了一株H9亞型禽流感病毒，并通過SPF雞致病性、EID50和IVPI等的測定確定分離到的毒株為低致病性禽流感病毒。

對分離到的H9亞型禽流感毒株的NA亞型進行了分子生物學鑒定，確認分離到得H9亞型禽流感屬于H9N2亞型。

該毒株對MDCK細胞高度適應。經免疫保護試驗證明，細胞毒與胚毒制備的疫苗相比具有產生抗體效價高，抗體上升水平快等優(yōu)點。